Menghitung Jumlah Sel Retikulosit Metode Manual New Methylene Blue & Miller Disc

Retikulosit merupakan eritrosit imatur yang baru dilepaskan dari sumsum tulang ke dalam sirkulasi perifer, masih mengandung sisa RNA ribosomal yang dapat divisualisasi menggunakan pewarna supravital (CLSI, 2004; Koepke & Koepke, 1986). Pemeriksaan hitung retikulosit merupakan salah satu parameter hematologi yang digunakan secara luas untuk menilai aktivitas eritropoietik sumsum tulang secara in vivo (Marks & Glader, 2018). Metode manual menggunakan pewarna new methylene blue (NMB) tetap menjadi metode komparatif baku yang direkomendasikan CLSI dan ICSH untuk kalibrasi instrumen otomatis, serta menjadi metode utama di laboratorium yang belum memiliki fasilitas flow cytometry (CLSI, 2004; ICSH, 1998).

Definisi dan Dasar Biologis Retikulosit

Retikulosit didefinisikan sebagai eritrosit transisional antara sel darah merah berinti (normoblas) dan eritrosit matur (CLSI, 2004). Sel ini diidentifikasi melalui keberadaan RNA ribosomal yang membentuk granula atau filamen biru ketika diwarnai dengan pewarna supravital seperti NMB atau brilliant cresyl blue (ICSH, 1998). Kriteria diagnostik visual mengharuskan adanya minimal dua granula biru terpisah yang tidak terletak di tepi membran sel, agar tidak tertukar dengan badan Heinz (Gilmer & Koepke, 1976; CLSI, 2004).

Retikulosit secara normal beredar dalam sirkulasi selama sekitar satu hingga dua hari sebelum mencapai tahap eritrosit matur (Houwen, 1992). Kecepatan maturasi bersifat bergantung pada kadar eritropoietin; stimulasi eritropoietik yang meningkat mendorong pelepasan retikulosit imatur lebih awal dari sumsum tulang (Houwen, 1992).

Signifikansi Klinis

Hitung retikulosit digunakan secara luas dalam berbagai konteks diagnostik dan pemantauan terapeutik (Marks & Glader, 2018; Greer et al., 2014).

• Klasifikasi Anemia
  

  Hitung retikulosit mutlak memungkinkan pembedaan anemia hipoproliferatif dari anemia hemolitik atau anemia pascaperdarahan akut (Marks & Glader, 2018). Peningkatan hitung retikulosit menunjukkan respons sumsum tulang yang adekuat terhadap anemia, sedangkan hitung retikulosit yang rendah secara tidak proporsional terhadap derajat anemia mengindikasikan kegagalan sumsum tulang atau defisiensi nutrien eritropoietik seperti besi, vitamin B12, atau folat (Goodnough et al., 2000; Greer et al., 2014).

• Pemantauan Terapi
  

  Parameter ini digunakan untuk memantau respons terhadap suplementasi besi, vitamin B12, folat, maupun terapi eritropoietin rekombinan pada pasien gagal ginjal kronik (Goodnough et al., 2000). Krisis retikulositosis umumnya tampak lima hingga sepuluh hari setelah inisiasi terapi yang efektif (Greer et al., 2014).

• Deteksi Krisis Aplastik
  

  Penurunan tiba-tiba hitung retikulosit pada pasien dengan anemia hemolitik kronik seperti anemia sel sabit atau sferositosis herediter menandakan terjadinya krisis aplastik, umumnya akibat infeksi Parvovirus B19 (Marks & Glader, 2018; Greer et al., 2014).

Prinsip Metode

Metode NMB merupakan metode pewarnaan supravital terhadap RNA ribosomal intraseluler retikulosit yang menghasilkan granula atau filamen berwarna biru yang dapat diidentifikasi di bawah mikroskop cahaya menggunakan lensa imersi minyak (d'Onofrio et al., 2002; CLSI, 2004; Brown, 1993). Metode ini memiliki keterbatasan inheren berupa impresisi yang relatif tinggi akibat jumlah sel yang dihitung terbatas serta subjektivitas analis dibandingkan metode otomatis berbasis flow cytometry (CLSI, 2004).

Spesimen dan Penanganan Pra-Analitik

• Pengambilan dan Antikoagulan
  

  Spesimen yang digunakan adalah darah vena utuh yang dikumpulkan ke dalam tabung EDTA dengan konsentrasi akhir 3,7-5,4 µmol/mL atau setara 1,5-2,2 mg/mL (CLSI, 2004). Antikoagulan lain seperti heparin atau sitrat belum dievaluasi secara memadai untuk keperluan penghitungan retikulosit (CLSI, 2004; WHO, 2002). Tabung wajib dihomogenisasi melalui inversi lembut sebanyak delapan hingga sepuluh kali sebelum analisis guna memastikan homogenitas suspensi sel.

• Stabilitas Spesimen
  

  Penghitungan retikulosit sebaiknya dilakukan dalam enam jam setelah pengambilan darah apabila disimpan pada suhu ruang (18-22 °C) (CLSI, 2004). Penyimpanan melebihi enam jam memerlukan suhu refrigerator (2-6 °C) guna mencegah maturasi in vitro yang dapat menyebabkan kehilangan retikulosit hingga 20% per 24 jam pada suhu ruang (CLSI, 2004). Spesimen yang disimpan pada 2-6 °C dapat stabil hingga 72 jam.

• Evaluasi Integritas Spesimen
  

  Spesimen dengan hemolisis berat merupakan dasar penolakan karena eritrolisis mengurangi jumlah sel yang tersedia untuk analisis (CLSI, 2004). Keberadaan bekuan darah signifikan atau paparan suhu ekstrem harus dicatat sebagai potensi komplikasi yang dapat mempengaruhi hasil.

Alat dan Bahan

Pemeriksaan retikulosit metode manual memerlukan alat dan bahan sebagai berikut:

Alat:

• Kaca objek
• Mikroskop cahaya dengan lensa imersi minyak
• Cakram Miller (Miller disc), opsional
• Tabung reaksi atau tabung kapiler
• Pipet

Bahan:

• Larutan new methylene blue (NMB)
• Darah EDTA segar

Pembuatan Larutan Pewarna NMB:

NMB (basa biru 24, colour index 52030) dengan kandungan zat warna sekitar 90% ditimbang sebanyak 0,1 gram, kemudian dilarutkan ke dalam 100 mL larutan penyangga fosfat iso-osmotik pH 7,4 yang terdiri dari campuran 18 mL NaH₂PO₄ 150 mmol/L dan 82 mL Na₂HPO₄ 150 mmol/L (CLSI, 2004). Larutan dikocok berkala selama 24 jam, disimpan dalam botol kaca gelap pada suhu 2-6 °C dengan masa simpan sekitar satu bulan. Larutan wajib disaring melalui kertas saring sebelum digunakan untuk menghilangkan endapan dan partikel yang dapat mengganggu interpretasi morfologi sel (ICSH, 1998; CLSI, 2004).

Prosedur Pemeriksaan

1. Persiapan Sediaan Apus
   

   Volume darah yang ekuivalen dengan volume larutan NMB dicampur ke dalam tabung kaca atau plastik; perbandingan pewarna terhadap darah dapat disesuaikan pada sampel anemia atau polisitemia (CLSI, 2004). Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 3–10 menit. Campuran dihomogenkan kembali sesaat sebelum setetes diletakkan di atas kaca objek untuk dibuat apusan tipis yang menutupi sekitar dua pertiga permukaan kaca. Sediaan dikeringkan dengan cepat menggunakan aliran udara hangat guna mencegah perubahan morfologi sel.

2. Prosedur Penghitungan
   

   Sediaan diperiksa di bawah pembesaran rendah (100×) untuk memverifikasi distribusi eritrosit yang merata, berdekatan tanpa saling menumpuk. Penghitungan dilakukan menggunakan lensa imersi minyak dengan mengikuti pola battlement, yakni pergerakan zig-zag dari satu tepi ke tepi lapang pandang secara sistematis (CLSI, 2004). Jumlah sel minimum yang harus dihitung bergantung pada persentase retikulosit yang ditargetkan dan derajat presisi yang dikehendaki (lihat Tabel 1).

3. Penggunaan cakram Miller (Miller disc) mengharuskan penerapan aturan tepi (edge rule): eritrosit yang menyentuh sisi bawah dan sisi kanan kotak kecil tidak dihitung (Brecher & Schneiderman, 1950 dalam CLSI, 2004). Ketidakpatuhan terhadap aturan ini mengakibatkan bias sistematik yang menyebabkan hasil hitung sekitar 30% lebih rendah dibandingkan penghitungan tanpa cakram (CLSI, 2004).

4. Kalkulasi
   

   Tanpa cakram Miller, persentase retikulosit dihitung menggunakan persamaan berikut (CLSI, 2004):

   $$\text{Retics (\%)} = \frac{\text{Jumlah total retikulosit} \times 100}{\text{Jumlah total eritrosit} + \text{Jumlah total retikulosit}}$$

   Apabila cakram Miller digunakan, kalkulasi menggunakan persamaan (CLSI, 2004):

   $$\text{Retics (\%)} = \frac{\text{Total retikulosit dalam 20 kotak besar} \times 100}{\text{Total eritrosit dalam 20 kotak kecil} \times 9}$$

   Hitung retikulosit mutlak diperoleh melalui persamaan (CLSI, 2004):

   $$\text{Hitung retikulosit mutlak } (\times 10^9/\text{L}) = \text{Hitung eritrosit } (\times 10^{12}/\text{L}) \times \text{Retics (\%)} \times 10^{-2}$$

   Pelaporan hitung retikulosit hanya dalam bentuk persentase dianggap tidak memadai dalam praktik klinis modern; hitung mutlak (×10⁹/L) wajib dilaporkan karena lebih mencerminkan aktivitas eritropoietik yang sesungguhnya (CLSI, 2004).

Presisi dan Jumlah Sel yang Dihitung

Presisi penghitungan retikulosit bersifat bergantung binomial; semakin sedikit sel yang dihitung, semakin lebar interval kepercayaan yang dihasilkan (CLSI, 2004). Tabel 1 menyajikan jumlah eritrosit minimum yang perlu dihitung untuk mencapai koefisien variasi (CV) tertentu pada berbagai persentase retikulosit. Sel bertanda “−” menunjukkan bahwa jumlah sel yang diperlukan pada tingkat presisi tersebut melebihi rentang yang lazim dihitung secara manual sehingga tidak dicantumkan dalam tabel acuan asli (CLSI, 2004).

Tabel 1. Jumlah eritrosit yang harus dihitung untuk mencapai tingkat presisi yang ditentukan

Retikulosit (%)	CV 2%	CV 5%	CV 10%
0,05	47.500	7.600	1.900
0,10	22.500	3.600	900
0,50	2.500	400	100
1,00	−	1.600	400
5,00	−	400	100

Diadaptasi dari CLSI (2004), Tabel 1. Untuk metode manual, minimum 2.000 eritrosit harus dihitung.

Sebagai ilustrasi, hitung retikulosit 1% dengan 1.000 sel yang dihitung menghasilkan batas kepercayaan 95% sebesar 0,4-1,6%, sehingga penghitungan jumlah sel yang lebih banyak diperlukan apabila presisi yang lebih tinggi dikehendaki (CLSI, 2004).

Interval Referensi

Interval referensi bersifat spesifik terhadap metode dan pewarna yang digunakan, sehingga setiap laboratorium wajib menetapkan atau mengonfirmasi interval referensinya sendiri (CLSI, 2004). Penetapan dilakukan menggunakan minimal 100 subjek dewasa sehat berusia 18-50 tahun dengan proporsi jenis kelamin yang seimbang (CLSI, 2004). Distribusi data umumnya bersifat log-normal sehingga rentang sentral 95%, bukan mean ±2 SD, yang digunakan sebagai interval referensi (CLSI, 2004).

Interval referensi tentatif untuk metode NMB manual adalah rerata 48 ×10⁹/L dengan rentang 95% sebesar 20-110 ×10⁹/L (CLSI, 2004). Variabilitas diurnal biologis yang signifikan, sekitar ±20% dari rerata hitung retikulosit, dilaporkan terjadi dalam periode empat minggu (Jones et al., 1996).

Keterbatasan Metode Manual

Metode NMB manual memiliki keterbatasan presisi yang signifikan dibandingkan metode otomatis berbasis flow cytometry karena jumlah sel yang dapat dihitung secara visual jauh lebih terbatas, umumnya 1.000 sel dibandingkan 30.000 sel atau lebih pada instrumen otomatis (Davis et al., 1994; Buttarello et al., 2001). Subjektivitas antar analis dalam mengidentifikasi granula retikulosit yang samar juga merupakan sumber variabilitas yang signifikan (CLSI, 2004). Metode manual karenanya direkomendasikan sebagai metode komparatif untuk kalibrasi instrumen otomatis, atau sebagai metode utama di laboratorium yang belum memiliki fasilitas flow cytometry (CLSI, 2004; d'Onofrio et al., 2002).

Referensi

1. Brecher G, Schneiderman M. A time-saving device for the counting of reticulocytes. Am J Clin Pathol. 1950;20(11):1079–1083.
2. Brown BA. Hematology: Principles and Procedures. 6th ed. Philadelphia: Lea & Febiger; 1993.
3. Buttarello M, Bulian P, Farina G, et al. Flow cytometric reticulocyte counting - parallel evaluation of five fully automated analyzers: an NCCLS-ICSH approach. Am J Clin Pathol. 2001;115(1):100-111.
4. CLSI. Methods for Reticulocyte Counting (Automated Blood Cell Counters, Flow Cytometry, and Supravital Dyes); Approved Guideline-Second Edition. CLSI document H44-A2. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2004.
5. d'Onofrio G, Zini G, Rowan RM. Reticulocyte counting: methods and clinical applications. In: Rowan RM, van Assendelft OW, Preston FE, eds. Advanced Laboratory Methods in Haematology. London: Arnold; 2002:78-126.
6. Davis BH, Bigelow NC, Koepke JA, et al. Flow cytometric reticulocyte analysis: multiinstitutional interlaboratory correlation study. Am J Clin Pathol. 1994;102(4):468-477.
7. Gilmer PR, Koepke JA. The reticulocyte: an approach to definition. Am J Clin Pathol. 1976;66(3):262-267.
8. Goodnough LT, Skikne B, Brugnara C. Erythropoietin, iron, and erythropoiesis. Blood. 2000;96(3):823-833.
9. Greer JP, Arber DA, Glader B, et al., eds. Wintrobe's Clinical Hematology. 13th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2014.
10. Houwen B. Reticulocyte maturation. Blood Cells. 1992;18(2):167-186.
11. International Council for Standardization in Haematology (ICSH). Proposed reference method for reticulocyte counting based on the determination of the reticulocyte to red cell ratio. Clin Lab Haematol. 1998;20(2):77-79.
12. Jones AR, Twedt D, Swaim W, Gottfried E. Diurnal change of blood count analytes in normal subjects. Am J Clin Pathol. 1996;106(6):723-727.
13. Koepke JF, Koepke JA. Reticulocytes. Clin Lab Haematol. 1986;8(3):169-179.
14. Marks PW, Glader B. Approach to anemia in the adult and child. In: Hoffman R, Benz EJ, Silberstein LE, et al., eds. Hematology: Basic Principles and Practice. 7th ed. Philadelphia: Elsevier; 2018:429-437.
15. World Health Organization. Use of Anticoagulants in Diagnostic Laboratory Investigations. WHO/DIL/LAB/99.1 Rev. 2. Geneva: WHO; 2002.