Pengecatan Gram

Pewarnaan Gram merupakan teknik mikrobiologi fundamental yang telah menjadi dasar identifikasi bakteri selama lebih dari satu abad. Awalnya dikembangkan oleh Christian Gram pada tahun 1884 dan kemudian dimodifikasi oleh Hucker pada tahun 1921, prosedur pewarnaan diferensial ini tetap menjadi alat diagnostik penting dalam mikrobiologi modern. Pewarnaan Gram mengklasifikasikan bakteri berdasarkan struktur dinding selnya dan memberikan informasi berharga tentang morfologi, susunan, dan identifikasi awal bakteri. Teknik ini memiliki berbagai tujuan: memungkinkan diagnosis presumptif cepat agen infeksi langsung dari spesimen klinis, menilai kualitas spesimen, dan memberikan panduan penting untuk pengujian mikrobiologi selanjutnya.

Pewarnaan Gram telah berkembang dari formulasi aslinya untuk mencakup berbagai modifikasi, seperti modifikasi Kopeloff, yang menggunakan pewarna tandingan basic fuchsin atau carbol fuchsin yang sangat berguna untuk mewarnai bakteri anaerob dan bakteri Gram-negatif yang lemah seperti Legionella, Campylobacter, dan Brucella.

Tujuan

• Untuk membedakan bakteri menjadi kategori Gram-positif dan Gram-negatif
• Untuk mengamati ukuran, bentuk, dan morfologi sel bakteri
• Untuk menilai kualitas spesimen klinis
• Untuk memberikan diagnosis presumptif yang cepat dari agen infeksi
• Untuk memandu terapi antimikroba yang tepat sebelum hasil kultur tersedia

Prinsip

Pewarnaan Gram membedakan bakteri berdasarkan perbedaan komposisi dan arsitektur dinding selnya. Bakteri Gram-positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan jumlah asam teikoat yang besar. Struktur ini memungkinkan mereka untuk mempertahankan kompleks kristal violet-iodin selama langkah dekolorisasi, menghasilkan penampilan ungu tua karakteristik mereka ketika tidak rusak oleh usia, agen antimikroba, atau faktor lainnya.

Sebaliknya, bakteri Gram-negatif memiliki lapisan peptidoglikan tunggal yang melekat pada membran luar bilayer lipopolisakarida-fosfolipid asimetris yang diselingi dengan protein. Selama prosedur pewarnaan, dekolorizer berbasis alkohol merusak membran luar ini, memungkinkan kompleks kristal violet-iodin bocor keluar. Sel yang telah didekolorisasi kemudian menyerap pewarna tandingan, sehingga tampak merah muda atau merah.

Interpretasi preparat yang diwarnai dengan Gram memerlukan pertimbangan tidak hanya karakteristik pewarnaan tetapi juga ukuran sel, bentuk, dan susunan. Karakteristik ini dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, termasuk umur kultur, media, atmosfer inkubasi, metode pewarnaan, dan adanya zat penghambat, termasuk paparan antibiotik. Pertimbangan serupa berlaku saat menginterpretasikan preparat yang dibuat langsung dari spesimen klinis, dengan faktor tambahan termasuk keberadaan jenis sel inang tertentu dan bukti fagositosis.

Persiapan Reagen Pewarnaan Gram

Kristal Violet Hucker (A)

1. Larutan stok kristal violet

      Kristal violet (kandungan pewarna 90 hingga 95%)... 	40 g
      Etanol, 95%...					400 ml
      

   Larutkan (mungkin perlu dibiarkan semalaman) dan campur dalam botol kaca, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

   Perhatian: Etanol mudah terbakar.

2. Larutan amonium oksalat (1%)

      Amonium oksalat (reagent grade)...	16 g
      Air suling...			1.600 ml
      

   Larutkan dan campur dalam botol kaca coklat, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

3. Larutan kerja kristal violet

       Larutan stok kristal violet...	40 ml
       Larutan amonium oksalat (1%)...	160 ml
      

   Saring larutan stok kristal violet ke dalam botol kaca. Biarkan menyaring sepenuhnya, dan kemudian saring larutan amonium oksalat. Beri label dengan tanggal kedaluwarsa paling awal dari larutan stok.

Iodin Gram (B)

1. Larutan stok Lugol's iodin

   Kristal iodin (reagent grade)...	25 g
   Kalium iodida (reagent grade)...	50 g
   Air suling...		500 ml

   Campur atau biarkan sampai larut dalam botol kaca coklat, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 6 bulan, dan simpan pada suhu ruangan.

2. Natrium bikarbonat, 5% (b/v)

   Natrium bikarbonat (NaHCO₃), reagent grade...	50 g
   Air suling...					1.000 ml

   Larutkan dalam botol kaca, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

3. Iodin Gram

   Larutan stok Lugol's iodin...	60 ml
   Air suling... 			220 ml
   Natrium bikarbonat, 5%...	60 ml

   Campur dalam botol kaca coklat, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 6 bulan, dan simpan pada suhu ruangan.

   Perhatian: Iodin dan kalium iodida bersifat korosif. Hindari inhalasi, konsumsi, dan kontak kulit. Jangan simpan dekat asam.

Counterstain (C)

1. Safranin
   • Larutan stok safranin

     Safranin O (bersertifikat)...	5,0 g
     Etanol, 95%... 			200 ml

     Larutkan dalam botol kaca, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

     Perhatian: Etanol mudah terbakar.

   • Larutan kerja safranin

     Larutan stok safranin...	20 ml
     Air suling...			180 ml

     Gabungkan dalam botol kaca, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

2. Basic fuchsin, 0,1, 0,2, atau 0,8% (b/v)

   Basic fuchsin (reagent grade)...	1, 2, atau 8 g
   Etil alkohol...				100 ml
   Air suling...				900 ml

   Tambahkan basic fuchsin ke botol kaca coklat. Perlahan tambahkan etil alkohol dan biarkan semalam. Saring melalui kertas saring Whatman no. 1. Tambahkan air suling. Beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

3. Pewarna tandingan carbol fuchsin
   • Larutan A

     Basic fuchsin (reagent grade)...	3 g
     Etanol, 95%...				100 ml

   • Larutan B

     Kristal fenol yang meleleh...	50 ml
     Air suling...			950 ml

   Larutkan basic fuchsin dalam etanol dalam botol kaca coklat (larutan A). Tambahkan fenol ke air suling dalam labu terpisah (larutan B). Tambahkan larutan B ke larutan A, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

   Perhatian: Etanol mudah terbakar, dan fenol bersifat korosif. Hindari inhalasi, konsumsi, dan kontak kulit.

Modifikasi Kopeloff (untuk bakteri anaerob) (D)

1. Kristal violet alkalin
   • Larutan A

     Kristal violet (kandungan pewarna 90 hingga 95%)...	10 g
     Air suling...						1.000 ml

     Larutkan dalam botol kaca, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan dalam botol dengan tutup kaca pada suhu ruangan.

   • Larutan B: natrium bikarbonat, 5% (b/v)

     Natrium bikarbonat (NaHCO₃) (reagent grade)...	50 g
     Air suling...					1.000 ml

     Larutkan dalam botol kaca, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

2. Iodin (modifikasi Kopeloff)

   Natrium hidroksida (NaOH) (reagent grade)...	4 g
   Air suling... 					25 ml
   Kristal iodin (reagent grade)... 		20 g
   Kalium iodida (reagent grade)... 		1 g
   Air suling... 					975 ml

   Larutkan NaOH dalam 25 ml air suling dalam botol kaca coklat. Tambahkan iodin dan kalium iodida, dan larutkan dengan baik. Secara bertahap tambahkan 975 ml air suling, aduk rata setelah setiap penambahan.

   Perhatian: Iodin dan kalium iodida bersifat korosif. Hindari inhalasi, konsumsi, dan kontak kulit.

3. Dekolorizer: aseton-alkohol 3:7

   Etanol, 95%... 			700 ml
   Aseton (reagent grade)... 	300 ml

   Gabungkan dan campur dalam botol kaca coklat, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan.

   Perhatian: Etanol dan aseton mudah terbakar.

4. Pewarna tandingan safranin (Kopeloff)

   Safranin O, bersertifikat...	20 g
   Etanol, 95%... 			100 ml
   Air suling... 			1.000 ml

   Dalam botol kaca 1.000 ml, tambahkan hanya cukup etanol ke safranin untuk melarutkannya (sekitar 50 ml). Tambahkan air suling ke larutan safranin, beri label dengan tanggal kedaluwarsa 1 tahun, dan simpan pada suhu ruangan. (Basic fuchsin, 0,8% [b/v], juga dapat digunakan untuk pewarnaan tandingan.)

   Perhatian: Etanol mudah terbakar.

Alat dan Bahan

Reagen

1. Kristal violet (pewarna primer)
   • Modifikasi Hucker
   • Kristal violet Kopeloff
2. Iodin (mordan)
   • Reagen Gram
   • Iodin Kopeloff
3. Dekolorizer (bervariasi dalam kecepatan dan intensitas)
   • Paling lambat: Etanol, 95%
   • Menengah: Aseton-alkohol (campuran 50:50)
   • Paling cepat: Aseton (reagent grade)
4. Counterstain
   • Safranin
   • Carbol fuchsin
   • Basic fuchsin (0,8%, 0,1%, atau 0,2%)
   • Safranin Kopeloff
5. Bahan kimia lainnya
   • Metanol, absolut (untuk fiksasi)

Peralatan

1. Pensil lilin
2. Kaca objek yang telah dibersihkan (25 × 75 mm), sebaiknya dengan ujung buram
3. NaCl 0,85% steril (saline), air, atau kaldu
4. Pipet Pasteur steril, tongkat aplikator kayu, jarum ose, atau jarum
5. Wadah pembuangan limbah biologis, termasuk wadah benda tajam
6. Tabung steril dengan tutup
7. Gunting, pisau bedah, dan pinset steril
8. Minyak imersi
9. Sterilizer meja
10. Pemanas kaca objek listrik (45-60°C)
11. Sentrifugasi cytospin (untuk cairan tubuh)
12. Vortex mixer
13. Wadah untuk pengumpulan pewarna beracun

Prosedur

Persiapan Preparat

1. Untuk preparat langsung, siapkan lapisan tunggal organisme yang cukup padat untuk visualisasi mudah tetapi cukup jarang untuk menunjukkan susunan karakteristik. Sebagai panduan, cetakan koran harus terlihat melalui preparat.
2. Persiapan spesifik spesimen:
   • Cairan tubuh, cairan lavage bronkoalveolar (BAL), dan CSF: Tempatkan 5-6 tetes sampel ditambah 1 tetes formalin 37% ke dalam chamber spesimen cytospin dan sentrifugasi. Alternatifnya, untuk spesimen kental atau keruh, transfer 1-2 tetes langsung ke kaca objek.
   • Spesimen urin: Tempatkan 10 μl urin yang telah dicampur rata, tidak disentrifugasi, pada kaca objek yang ditandai dan biarkan kering tanpa menyebarkan.
   • Spesimen swab: Gulingkan swab dengan lembut di seluruh kaca objek untuk menghindari kerusakan elemen seluler dan gangguan susunan bakteri.
   • Aspirat, eksudat, sputum, dll.: Pilih bagian yang purulen atau bernoda darah dan sebarkan di area yang luas untuk membentuk film tipis.
   • Spesimen biopsi dan potongan jaringan: Gunakan teknik preparasi sentuhan atau preparasi hapusan tipis.
   • Kultur kaldu: Transfer 1-2 tetes ke kaca objek dan sebarkan menjadi film tipis yang rata.
   • Koloni dari media padat: Tempatkan setetes saline steril pada kaca objek, transfer sebagian kecil koloni, dan campurkan dengan lembut untuk mengemulsikan.

Fiksasi Preparat

1. Keringkan kaca objek di dalam kabinet biosafety atau tertutup pada pemanas kaca objek pada suhu 60°C sampai kering.
2. Fiksasi panas:
   • Lewatkan kaca objek yang sudah kering udara dua atau tiga kali melalui api, atau tahan kaca objek terhadap bagian depan mikroinsinerator selama 5-10 detik. Untuk menghindari distorsi, jangan terlalu panas.
   • Biarkan kaca objek dingin sebelum pewarnaan.
3. Alternatifnya, fiksasi dengan metanol:
   • Tempatkan beberapa tetes metanol pada kaca objek yang sudah kering udara selama 1 menit.
   • Keringkan sisa metanol tanpa membilas, dan biarkan kaca objek kering udara lagi.
   • Jangan panaskan sebelum pewarnaan.

Prosedur Pewarnaan

Modifikasi Hucker (paling umum digunakan)

1. Genangi preparat yang telah difiksasi dengan larutan kristal violet. Biarkan pewarna selama 30 detik.
2. Buang kristal violet, dan bilas kaca objek perlahan dengan air keran mengalir.
3. Bilas kelebihan air dengan larutan iodin, kemudian genangi kaca objek dengan larutan iodin segar. Biarkan iodin selama 30 detik.
4. Bilas iodin perlahan dengan air keran mengalir.
5. Dekolorisasi dengan membiarkan reagen mengalir di atas preparat sementara kaca objek dipegang miring. Hentikan ketika aliran menjadi jernih.
6. Buang kelebihan dekolorizer dengan aliran lembut air keran.
7. Genangi kaca objek dengan pewarna tandingan dan biarkan selama minimal 30 detik (≥1 menit dengan pewarna fuchsin).
8. Buang kelebihan pewarna tandingan dengan aliran lembut air keran.
9. Keringkan kaca objek, dan keringkan di posisi tegak atau gunakan pengering kaca objek komersial.

Modifikasi Kopeloff (untuk bakteri anaerob dan vaginosis bakterial)

1. Genangi preparat yang telah difiksasi dengan larutan A (kristal violet). Tambahkan sekitar 5 tetes larutan B (natrium bikarbonat 5%). Kipas atau tiup kaca objek untuk mencampur. Biarkan pewarna selama 15-30 detik atau hingga 2 menit, tetapi jangan biarkan kering pada kaca objek.
2. Bilas kaca objek perlahan dengan iodin Kopeloff.
3. Aplikasikan iodin Kopeloff segar selama minimal 2 menit.
4. Pegang kaca objek dalam posisi miring, dan aplikasikan dekolorizer. Bilas segera.
5. Beri pewarna tandingan dengan safranin Kopeloff selama minimal 30 detik.
6. Bilas kelebihan pewarna tandingan dengan lembut menggunakan air keran mengalir. Keringkan kaca objek, dan keringkan di udara.

Interpretasi

Pengamatan Daya Rendah

1. WBC dan RBC menunjukkan proses infeksi. Perhatikan bahwa pasien neutropenik mungkin memiliki sedikit WBC, tetapi mungkin memiliki debris nekrotik dan protein di latar belakang.
2. Sel epitel skuamosa (SEC), sisa makanan, dll., menunjukkan spesimen yang tidak dikumpulkan dengan benar.
3. Keberadaan mikroorganisme tertentu (misalnya, hifa bercabang) menunjukkan proses infeksi.

Pengamatan Minyak Imersi

1. Amati mikroorganisme untuk morfologi karakteristik dan presentasi.
2. Klasifikasi reaksi Gram:
   • Gram-positif: ungu tua
   • Gram-negatif: merah muda atau merah (pewarna tandingan carbol fuchsin memiliki warna yang lebih intens)
   • Gram-variabel: kedua sel Gram-positif dan Gram-negatif dengan morfologi yang sama
   • Gram-netral: tidak menyerap kristal violet atau pewarna tandingan (tampak tidak berwarna terhadap latar belakang Gram-negatif, sering terlihat pada fungi atau Mycobacterium spp.)
3. Perhatikan karakteristik pewarnaan, bentuk dominan, ukuran relatif, dan susunan karakteristik mikroorganisme.

Signifikansi Klinis

• Keberadaan mikroorganisme dari situs yang biasanya steril kemungkinan menunjukkan infeksi dengan organisme tersebut.
• Untuk urin yang tidak disentrifugasi, keberadaan mikroorganisme kemungkinan menunjukkan jumlah bakteri ≥10⁵ CFU/ml.
• Keberadaan sejumlah besar satu jenis mikroorganisme dalam spesimen yang dikumpulkan secara non-invasif, terutama jika terkait dengan WBC, kemungkinan menunjukkan infeksi.
• Berhati-hatilah dengan interpretasi yang dibuat dari pengamatan sangat sedikit organisme, terutama jika tidak ada peradangan atau jika organisme tersebar tidak merata.

Kontrol Kualitas

Periksa penampilan reagen setiap hari. Jika kristal violet memiliki presipitat atau sedimen kristal, saring kembali sebelum digunakan. Ganti larutan kerja secara teratur jika tidak habis dengan penggunaan normal untuk mencegah penguapan yang dapat mengubah efektivitas. Batasi penggunaan kembali wadah pewarna kerja dengan membuang setidaknya setiap bulan untuk menghindari kontaminasi. Uji prosedur pewarnaan laboratorium sebelum menggunakan lot baru dari setiap reagen pewarnaan dan dekolorisasi dan setidaknya mingguan setelahnya, menggunakan organisme kontrol Gram-positif dan Gram-negatif (Escherichia coli ATCC 25922 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923). Untuk staf laboratorium yang jarang melakukan pewarnaan Gram, mungkin tepat bagi mereka untuk menguji kontrol positif dan negatif setiap hari atau bahkan dengan setiap spesimen pasien yang diuji. Ambil tindakan korektif ketika preparat yang diwarnai menunjukkan bukti kualitas buruk, pewarna sulit diinterpretasikan, atau interpretasi tidak akurat. Karakteristik pewarnaan yang buruk mungkin disebabkan oleh masalah persiapan spesimen, masalah reagen, atau kesalahan prosedural. Buat sistem untuk meninjau laporan pewarnaan Gram untuk memastikan akurasi, termasuk tinjauan supervisor atas slide yang dipilih dan perbandingan hasil kultur dengan temuan pewarnaan Gram. Pertahankan set slide referensi untuk pelatihan kompetensi.

Kelebihan dan Keterbatasan

Pewarnaan Gram menawarkan banyak kelebihan sebagai alat diagnostik. Ini cepat, hemat biaya, dan memberikan informasi segera untuk memandu keputusan terapi awal. Ini memungkinkan klasifikasi bakteri berdasarkan struktur dinding sel sambil mengungkapkan fitur morfologi penting. Prosedur ini memerlukan peralatan minimal dan dapat dilakukan di hampir semua pengaturan laboratorium. Ini membantu menilai kualitas spesimen dan dapat memantau efektivitas terapi antimikroba. Namun, teknik ini memiliki beberapa keterbatasan. Sensitivitasnya sekitar 10⁵ sel/ml, atau 10⁴ sel/ml dengan sitosentrifugasi. Hasil pewarnaan Gram positif dengan kultur negatif dapat terjadi karena kontaminasi reagen, keberadaan agen antimikroba, atau organisme fastidious yang memerlukan kondisi pertumbuhan khusus. Hasil palsu dapat berasal dari pengumpulan spesimen yang tidak tepat atau penundaan transportasi. Akurasi sangat bergantung pada pelatihan dan keterampilan mikroskopis. Beberapa organisme diwarnai dengan buruk atau tidak konsisten, seperti Mycobacteria atau organisme Gram-negatif yang mewarnai lemah. Prosedur tambahan seperti pewarnaan orange acridine mungkin diperlukan untuk spesimen purulen di mana tidak ada organisme yang diamati dengan pewarnaan Gram standar.

Catatan dan Tindakan Pencegahan

Selalu patuhi tindakan pencegahan standar saat menangani spesimen klinis. Proses dan tangani spesimen klinis di kabinet biosafety, termasuk persiapan slide pewarnaan Gram. Gunakan APD yang sesuai termasuk gaun dan sarung tangan, dan ikuti rekomendasi BSL2. Saat mewarnai, jangan aplikasikan reagen langsung ke area spesimen; sebagai gantinya, aplikasikan tetes di dekat ujung buram, membiarkannya mengalir di permukaan. Aplikasikan air dengan lembut ke bagian bawah kaca objek yang dimiringkan selama pembilasan untuk mencegah pencucian organisme Gram-positif dari kristal violet. Ketika memeriksa spesimen dari situs yang biasanya steril dengan organisme yang jarang atau tidak terlihat, tetapi penampilan mencurigakan, lakukan tinjauan yang lebih ekstensif pada slide. Untuk spesimen kritis seperti CSF, pertimbangkan untuk memeriksa seluruh slide dan menyiapkan preparat kedua untuk mengkonfirmasi temuan yang jarang. Simpan slide setidaknya selama satu minggu untuk memungkinkan tinjauan konfirmasi jika hasil kultur tidak konsisten. Saat membuang preparat yang telah diwarnai, tangani sebagai limbah biologis dan perlakukan slide sebagai benda tajam karena mereka dapat menembus kantong biohazard. Berhati-hatilah dengan reagen: etanol dan aseton mudah terbakar; fenol bersifat korosif; iodin dan kalium iodida dapat menyebabkan iritasi. Simpan bahan kimia dengan tepat sesuai dengan pedoman keselamatan.

Pelaporan Hasil

Jika tidak ada organisme atau sel yang terdeteksi dalam preparat spesimen klinis, laporkan "Tidak ada organisme yang terlihat" atau "Tidak ada sel yang terlihat".
Untuk preparat dengan temuan, laporkan:

1. Enumerasi sel di bawah objektif daya rendah
   • 1+ (jarang atau sesekali): <1/LPF
   • 2+ (sedikit): 1-9/LPF
   • 3+ (sedang): 10-25/LPF
   • 4+ (banyak): >25/LPF
2. Deskripsi jenis sel
   • Sel epitel
   • Sel polimorfonuklear (PMN)
   • Sel darah merah (RBC)
   • Material sel inang
3. Enumerasi bakteri di bawah objektif minyak imersi
   • 1+ (jarang atau sesekali): <1/LPF
   • 2+ (sedikit): 1-5/OIF
   • 3+ (sedang): 6-30/OIF
   • 4+ (banyak): >30/OIF
4. Deskripsi morfologi bakteri
   • Kokus Gram-positif dalam pasangan, rantai, atau kelompok
   • Basil Gram-positif (besar, kecil, bercabang, atau coryneform)
   • Diplokokus atau basil Gram-negatif
   • Bentuk Gram-variabel
   • Elemen fungi jika ada

Referensi

1. Gram C. 1884. Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten. Fortschritte der Medizin 2:185-189.
2. Hucker GJ. 1921. A new modification and application of the Gram stain. J Bacteriol 6:395–397.
3. Kopeloff N, Beerman P. 1922. Modified Gram stains. J Infect Dis 31:480–482.
4. Washington JA. 1986. Rapid diagnosis by microscopy. Clin Microbiol Newsl 8:135–137.
5. Church D, Melnyk E, Unger B. 2000. Quantitative Gram stain interpretation criteria used by microbiology laboratories in Alberta, Canada. J Clin Microbiol 38:4266–4268.
6. Murray PR, Washington JA. 1975. Microscopic and bacteriologic analysis of expectorated sputum. Mayo Clin Proc 50:339–344.
7. Bottone EJ. 1988. The Gram stain: the century-old quintessential rapid diagnostic test. Lab Med 19:288–291.
8. Clarridge JE, Mullins JM. 1987. Microscopy and staining, p 87–103. In Howard BJ (ed), Clinical and Pathogenic Microbiology. The CV Mosby Co, St. Louis, MO.
9. Weaver RE, Feeley JC. 1979. Cultural and biochemical characterization of the Legionnaire's disease bacterium, p 20–25. In Jones GL, Hebert GA (ed), Legionnaire's: the Disease, the Bacterium and Methodology. Center for Disease Control, Atlanta, GA.
10. Bartholomew JW. 1962. Variables influencing results, and the precise definition of steps in Gram staining as a means of standardizing the results obtained. Stain Technol 37:139–155.
11. Shanholtzer CJ, Schaper PJ, Peterson LR. 1982. Concentrated Gram stain smears prepared with a cytospin centrifuge. J Clin Microbiol 16:1052–1056.
12. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. 2007. Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology, 12th ed, p 828–829. Mosby Elsevier, St. Louis, MO.
13. Mangels JI, Cox ME, Lindberg LH. 1984. Methanol fixation: an alternative to heat fixation of smears before staining. Diagn Microbiol Infect Dis 2:129–137.
14. Atlas RM, Snyder JW. 2011. Reagents, stains, and media: bacteriology, p 272–303. In Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW (ed), Manual of Clinical Microbiology, 10th ed. ASM Press, Washington, DC.
15. Brown MS, Wu TC. 1986. The Gram stain morphology of fungi, mycobacteria, and Pneumocystis carinii. J Med Technol 3:495–499.
16. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. 1991. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of Gram stain interpretation. J Clin Microbiol 29:297–301.
17. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2015. Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria, 3rd ed. CLSI guideline M45. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.
18. The American Society for Microbiology. 2016. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 4th ed. ASM Press, Washington, DC.

```