Pembuatan Suspensi Sel 100%, 40%, 10%, 5 % & 3% Dalam Saline

Berbagi
Print

Pendahuluan


Suspensi sel darah merah (Red Cell Suspension) yang dibuat dari sampel bekuan harus bebas dari gumpalan, dan suspensi yang dibuat dari sampel antikoagulan yang baru harus bebas dari fibrin, yang keduanya dapat menyebabkan hasil yang salah. Tergantung pada media pensuspensi, suspensi sel dapat disimpan selama 8 jam atau lebih, pada +4°C ± 2°C. Suspensi sel darah merah diperlukan untuk semua uji hemaglutinasi. Suspensi sel darah merah memberikan rasio serum terhadap sel yang sesuai untuk memungkinkan penilaian dan interpretasi hasil tes.

Konsentrasi suspensi sel harus antara 2% dan 5% untuk uji aglutinasi tabung standar, dengan kekuatan ideal sekitar 3%. Suspensi yang jauh lebih lemah digunakan untuk teknik kolom mikro, seperti teknik kartu gel / gel card techniques (1% atau kurang), dan suspensi yang jauh lebih kuat (25% hingga 50%) untuk pengujian yang dilakukan pada golongan darah slide. Untuk suspensi yang lebih lemah yang diperlukan untuk kartu gel dan pengujian serupa, suspensi harus disiapkan menggunakan volume terukur spesifik dan larutan spesifik sesuai dengan jenis kartu/kolom yang digunakan, mengikuti instruksi pabrik. Teknik kartu kolom mikro (microcolumn card techniques) banyak digunakan untuk banyak tes pengelompokan darah termasuk uji silang serasi (crossmatching), baik manual maupun otomatis.

Untuk menjadi terampil dalam persiapan suspensi sel, pada praktikum dilaboratorium mencoba menemukan nilai untuk membuat suspensi akurat dari berbagai kekuatan, dari 1% sampai 5% dengan menambahkan 1 tetes sel darah merah ke 99 tetes salin dalam tabung reaksi untuk suspensi sel 1% yang akurat. Volume terukur serupa dapat digunakan untuk menyiapkan 2% (2 tetes sel dan 98 tetes salin), 3% (3 dan 97), 4% (4 dan 96) dan 5% (5 dan 95) suspensi (lihat tabel pengenceran pada prosedur untuk melihat keperluan pengenceran). Isi tabung harus dicampur dengan baik dan dibandingkan secara visual, dan warna dan konsistensi dipelajari dengan cermat, di berbagai area intensitas cahaya di laboratorium.

Untuk hasil pengujian laboratorium yang akurat, penting bahwa suspensi sel secara konsisten memiliki kekuatan yang sama untuk semua pengujian, dan tidak terlalu lemah atau terlalu kuat untuk metode yang digunakan. Untuk persiapan rutin suspensi sel (yaitu sampel donor atau pasien), penilaian visual dapat diterima. Dengan latihan semua petugas laboratorium harus dapat mengembangkan keterampilan mempersiapkan suspensi sel secara visual dengan benar.

Media suspensi sel darah merah dan cairan pengawet
  • Sel untuk pengujian rutin biasanya disuspensikan dalam normal ionic strength saline (NISS) untuk segera digunakan dan kemudian dibuang, atau disimpan untuk pekerjaan sehari (maksimum) jika perlu. Suspensi fosfat buffered saline (PBS) dapat disimpan selama 1 minggu. Untuk lingkungan kekuatan ionik rendah, seperti untuk tes AHG, reagen kekuatan ionik rendah dapat ditambahkan ke pengujian, atau low ionic strength saline (LISS) digunakan untuk menyiapkan suspensi sel.
  • Penting untuk membuat suspensi baru untuk pengujian ulang tetapi suspensi berlabel asli harus dipertahankan sampai pengujian selesai jika terjadi anomali atau investigasi kesalahan.
  • Sel darah merah reagen yang tersedia secara komersial adalah suspensi standar dalam cairan pengawet. Suspensi dapat disiapkan secara akurat dengan mengukur konsentrasi sel darah merah menggunakan penghitung sel, untuk memastikan bahwa mereka berada dalam kisaran tertentu. Sel panel (panel cells) dan banyak suspensi sel referensi juga disediakan dalam cairan pengawet yang siap digunakan. Penting untuk mengikuti instruksi pabrik saat menggunakan larutan komersial dan reagen komersial.
  • Suspensi sel darah merah reagen yang dipasok oleh pabrik memiliki tanggal kedaluwarsa sesuai dengan cairan pengawet yang digunakan. Ini mungkin sampai 6 minggu, seperti yang ditunjukkan pada label wadah.

Mengapa Pencucian Sel Merah Diperlukan
  • Rasio yang tepat dari plasma ke sel darah merah penting untuk akurasi dalam reaksi antigen-antibodi; konsentrasi sel yang terlalu berat dapat menyebabkan reaksi yang lemah atau negatif palsu.
  • Albumin pasien abnormal: Rasio globulin dapat menyebabkan pseudoaglutinasi, sehingga pencucian yang memadai penting dalam pembuatan suspensi sel. Sebelum dicuci, antigen terlarut seperti A dan B mungkin ada, yang dapat mengganggu hasil tes.
  • Wharton’s jelly, yang terdapat dalam darah tali pusat bayi baru lahir, dapat mempengaruhi reaksi aglutinasi.
  • Cold-acting autoimmune antibodies dan peningkatan kadar imunoglobulin dapat menyebabkan aglutinasi atau rouleaux.
  • Sel darah merah yang mengalami hemolisis karena pengambilan yang sulit akan mengganggu penilaian dan interpretasi hemolisis
  • Fibrinogen dapat menghasilkan pembentukan untaian fibrin yang membuat reaksi penilaian menjadi sulit.
Sel harus dicuci 4-5 kali dengan volume besar (5 mL) salin normal, untuk menghilangkan plasma. Suspensi sel yang lemah digunakan dalam tes hemaglutinasi, karena rasio serum terhadap sel mempengaruhi sensitivitas sebagian besar tes—jumlah minimum antibodi harus terikat pada sel darah merah untuk menghasilkan aglutinasi. Darah antikoagulan harus dicuci dengan normal salin untuk menghilangkan antibodi yang terkontaminasi.

Prosedur


Persiapan yang harus dilakukan siapkan sampel darah antikoagulan, tabung reaksi, pipet sekali pakai (serologis 1-mL dan 10-mL), salin, centrifuge (3000 rpm atau setara).

Langkah kerja
Ambil tabung kaca 12 × 75 mm dan beri label tabung sesuai nomor seri sampel atau nama pasien.

Tambahkan 1 mL darah antikoagulan atau 1 mL darah yang terkoagulasi (dari dasar tabung reaksi) dan 8 mL saline normal dengan menempatkan ujung botol pencuci tepat di atas tabung dan menekannya. Ini akan mencampur darah dan salin, meningkatkan efisiensi pencucian. Hindari kontaminasi tabung saat mengeluarkan salin ke beberapa tabung.

Karena sel darah merah yang dilapisi antibodi lebih berat daripada sel yang tidak dilapisi dan mengendap di bagian bawah sampel, isinya harus dicampur dengan baik sebelum darah dikeluarkan. Jika spesimen yang menggumpal digunakan, darah harus dikeluarkan dari dasar bekuan untuk alasan yang sama.

Sentrifugasi pada 2500 rpm selama 3 menit pada suhu kamar (2020, Pritam Singh Ajmani), sedangkan menurut AABB selama 5 menit 3000rpm.

Ketika centrifuge berhenti, keluarkan tabung reaksi dan tuang supernatant salin dan buang.

Cuci tiga kali seperti di atas sampai garam supernatan jernih.

Pencucian terakhir harus selalu memiliki supernatan bening tanpa tanda-tanda hemolisis.

Pertimbangkan pelet sel darah merah sebagai 100%. Kocok sel hingga lepas dari dasar tabung. Siapkan suspensi sel darah merah seperti yang ditunjukkan di bawah ini:

Persentase sel darah merah dengan metode mikropipet
RBC %1%2%3%5%10%20%40%45%
Saline 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL
PRBC 100 μL 200 μL 300 μL 500 μL 1000 μL2000 μL4000 μL4500 μL

Persentase sel darah merah dengan metode tetes
RBC %3%5%10%20%50%
Salin32 tetes20 tetes10 tetes5 tetes5 tetes
pRBC1 tetes1 tetes1 tetes 1 tetes5 tetes

Tutup atau tutup tabung dengan parafilm. Campurkan sel darah merah dan garam dengan hati-hati dengan membalik tabung beberapa kali.

Untuk membandingkan warna dan kerapatan suspensi dengan mata, pindahkan volume suspensi yang telah disiapkan ke tabung 10 × 75 mm. Juga pindahkan volume serupa dari suspensi sel darah merah 3% yang diketahui (misalnya, suspensi sel darah merah reagen komersial) ke tabung 10 × 75 mm lainnya. Pegang kedua tabung di depan sumber cahaya untuk membandingkannya.
Untuk membandingkan ukuran pelet sel yang diharapkan dari suspensi sel darah merah 3%, pindahkan 1 tetes suspensi yang disiapkan ke tabung 10 × 75 mm. Demikian pula, transfer 1 tetes suspensi sel darah merah reagen komersial 3% yang diketahui ke tabung 10 × 75 mm lainnya. Centrifuge tabung dalam centrifuge serologis, menggunakan waktu putaran yang ditentukan untuk "saline." Ukuran kedua pelet sel harus serupa.

Ilustrasi

Pustaka


  1. Pritam Singh Ajmani, (2020), Immunohematology and Blood banking Principles and Practice, Springer Nature Singapore Pte Ltd..
  2. Raman, L., Armstrong, B. and Smart, E. (2008), Principles of laboratory techniques. ISBT Science Series, 3: 33-60. https://doi.org/10.1111/j.1751-2824.2008.00186.x
  3. AABB, 2020, Technical Manual 20TH Edition, AABB

Tidak ada komentar:

Posting Komentar