Uji Methyl Red (MR) Pada Bakteri - Methyl Red Test

Pendahuluan

Uji Methyl Red (MR) digunakan untuk menentukan apakah suatu organisme mampu menghasilkan produk akhir asam yang stabil dari fermentasi glukosa. Indikator MR (warna merah di bawah pH 4,4; warna kuning pada pH 5,8) digunakan untuk menentukan pH setelah batang Gram-negatif enterik memfermentasi glukosa hingga selesai. Indikator pH ini berwarna merah pada kondisi asam di bawah pH 4,4, dan kuning pada pH di atas 6,2. Jadi, jika produk asam hadir dalam medium, medium akan menjadi lebih asam, menyebabkan indikator MR tetap merah ketika ditambahkan. Sebaliknya, jika organisme tidak menggunakan jalur fermentasi asam campuran, media akan tetap berada pada pH netral, menyebabkan indikator MR berubah dari merah menjadi kuning.

Uji MR digunakan untuk membedakan anggota family Enterobacteriaceae berdasarkan pola metabolisme glukosanya. Jika suatu organisme menggunakan jalur fermentasi asam campuran dan menghasilkan produk akhir asam yang stabil, itu dianggap positif untuk uji MR. Semua anggota Enterobacteriaceae memberikan reaksi MR positif ketika diuji hingga 24 jam karena konversi glukosa menjadi asam piruvat oleh jalur Embden-Meyerhof. Setelah inkubasi lebih lanjut (2 sampai 5 hari), organisme yang MR positif terus memetabolisme asam piruvat menjadi asam laktat, asetat, dan format melalui jalur asam campuran dan mampu mempertahankan pH asam. Organisme yang memanfaatkan jalur butylene glycol menghasilkan asetilmetilkarbinol (asetoin) dan butanadiol, produk akhir netral yang meningkatkan pH menuju netralitas (pH 6) dan menghasilkan pH akhir yang tinggi. Kebanyakan Enterobacteriaceae menunjukkan satu atau jalur metabolisme lainnya tetapi jarang keduanya.

Glucose - Pyruvate - Lactic acid, acetic acid, formic acid, dll.

Pembuatan Media
MR broth (pH 6.9), Bahan per liter dengan air deionisasi:

buffered peptone	7.0 g
glucose	5.0 g
dipotassium phosphate	5.0 g

Kebutuhan volume media umumnya sekitar 5 ml per tabung atau gunakan secukupnya untuk menutupi tabung Durham terbalik, jika digunakan.

Pesiapan reagen 40% kalium hidroksida (KOH) bersifat higroskopis dan menjadi kaustik saat lembab. Timbang dengan cepat dalam gelas beker yang telah ditera. Simpan jauh dari asam dan hindari paparan pada kulit. Larutkan 40 g pelet kalium hidroksida dalam 100 ml air suling dalam botol polietilen. Simpan botol dalam bak air dingin selama persiapan. Opsional: tambahkan 0,3 g kreatin (N-methyl-N-guanylglycine) untuk reaksi yang lebih cepat dan sensitif. Kreatin tidak boleh ditambahkan jika reagen digunakan untuk API 20E atau tablet dari Key Scientific, karena sudah ada di media. Simpan pada suhu 4 hingga 8^oC. Reagen dapat disimpan 2 hingga 3 minggu.

Reagen 5% Α-naftol (5 g/100 ml) dalam 95% etil alkohol. Simpan pada suhu 4 hingga 8^oC dalam gelap. Umur simpan: 2 hingga 3 minggu. Reagen harus hampir tidak berwarna.

Reagen MR, 0,02%, larutkan 0,1 g MR dalam 300 ml etil alkohol, 95%. Tambahkan air suling secukupnya untuk membuat 500 ml. Simpan pada suhu 4 hingga 8^oC dalam botol cokelat. Stabil selama 1 tahun.

Prosedur

Persiapan alat loop inokulasi kawat atau ose mata, bunsen, media Methyl Red dan Indikator pH Methyl Red.

Langkah kerja

Dengan teknik aseptik, inokulasi media MR dengan kultur bakteri yang sedang tumbuh.
Inkubasi pada suhu 35^oC selama minimal 48 jam.
Pindahkan kira-kira 1 ml media yang diinkubasi 48 jam ke dalam tabung 13x100 mm nonsteril. (Sisanya harus dicadangkan untuk pengujian pada 3 hingga 5 hari jika perlu.)
Tambahkan 3 sampai 6 tetes (atau 1 tetes sampai 0,5 ml) indikator MR ke dalam alikuot.
Amati media. Jika indikator pH MR tetap merah, organisme dianggap positif MR. Jika indikator pH MR berubah warna menjadi kuning, organisme dianggap negatif MR.

Pembacaan Hasil

Warna merah yang berbeda adalah reaksi positif.
Warna kuning merupakan reaksi negatif.
Warna merah-orange adalah hasil positif yang lemah.
Jika terlihat warna orange, inkubasi sisa media hingga 4 hari dan ulangi pengujian setelah inkubasi lebih lanjut. Dalam hal ini mungkin juga membantu untuk menyiapkan media duplikat pada suhu 25^oC.

Catatan

Jika bagian tengah satu koloni diinokulasi ke dalam volume 0,5 ml media MR, tes dapat dibaca pada 18 hingga 24 jam.
Beberapa organisme dapat menghasilkan acetylmethylcarbinol pada suhu kamar dan bukan pada suhu 35^oC (misalnya, Hafnia alvei, Yersinia, dan Listeria). Dalam hal ini, inokulasi media lain dan inkubasi pada suhu kamar.
Jika kultur media menggunakan volume 5 ml, pidahkan media alikuot 2,0 ml ke dalam tabung uji 13x100 mm nonsteril. Simpan sisanya untuk kemungkinan inkubasi ulang.
Jika media glukosa mengandung tabung Durham, berhati-hati untuk tidak terjadi gelembung udara ke dalamnya saat mengambil 2,0 ml media dituangkan ke dalam tabung nonsteril untuk pengujian.

Keterbatasan

Peningkatan paparan organisme terhadap oksigen atmosfer dalam teknik mikro mengurangi masa inkubasi.
Hindari overinokulasi. Pertumbuhan bakteri terhambat ketika inokulum melebihi kira-kira 109 sel hidup per ml.
Jika waktu inkubasi tidak cukup sebelum indikator MR ditambahkan, hasil positif palsu dapat diperoleh.

Ilustrasi

Pustaka

Amy L. Leber, 2016, Clinical Microbiology Procedures Handbook, 4th edition, American Society for Microbiology.
Subhash Chandra Parija, 2012. Textbook of Microbiology and Immunology, Second Edition, Elsevier
American Type Culture Collection (ATCC®), 2015, Introduction to Microbiology, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110