Pemeriksaan Protein Urin Dengan Pemanasan

Proteinuria merupakan salah satu temuan laboratorium yang penting dalam evaluasi fungsi ginjal dan berbagai kondisi patologis sistemik. Keberadaan protein dalam urin yang melebihi batas fisiologis normal mencerminkan gangguan pada mekanisme filtrasi glomerulus, reabsorpsi tubulus, atau peningkatan produksi protein berat molekul rendah yang melampaui kapasitas reabsorpsi ginjal (Tencer et al., 1998; Lamb et al., 2009). Pemeriksaan protein urin metode pemanasan dengan asam asetat merupakan salah satu metode klasik yang masih digunakan sebagai prosedur konfirmasi dan semikuantitatif di laboratorium klinik (Gandasoebrata, 1968; Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Prinsip Pemeriksaan

Metode pemanasan dengan asam asetat didasarkan pada sifat fisikokimia protein yang berada dalam keadaan koloid di dalam urin. Pemanasan menginduksi denaturasi termal protein sehingga terjadi presipitasi yang ditandai dengan timbulnya kekeruhan (Gandasoebrata, 1968). Penambahan asam asetat berfungsi untuk menurunkan pH larutan mendekati titik isoelektrik protein, khususnya albumin (pI ≈ 4,7), sehingga muatan netto protein mendekati nol dan daya larutnya berkurang secara bermakna (Gandasoebrata, 1968; Strasinger & Di Lorenzo, 2014). Proses presipitasi diperkuat oleh keberadaan garam-garam anorganik yang sudah terkandung secara alami dalam urin atau yang sengaja ditambahkan sebagai agen salting-out (Gandasoebrata, 1968).

Kekeruhan yang timbul sebelum penambahan asam asetat dapat disebabkan oleh protein maupun oleh kalsium fosfat atau kalsium karbonat. Penambahan asam asetat bersifat diagnostik diferensial: kekeruhan akibat kalsium fosfat dan kalsium karbonat akan larut kembali dalam suasana asam, sedangkan kekeruhan akibat protein akan menetap atau bahkan meningkat (Gandasoebrata, 1968; Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Signifikansi Klinis Proteinuria

Proteinuria persisten merupakan penanda klinis penting yang berkaitan dengan berbagai kondisi patologis (Lamb et al., 2009).

Proteinuria Glomerular

Kerusakan membran filtrasi glomerulus menyebabkan protein bermolekul besar, terutama albumin, lolos ke dalam filtrat glomerulus melebihi kapasitas reabsorpsi tubulus (Tencer et al., 1998). Kondisi ini dijumpai pada glomerulonefritis, sindrom nefrotik, diabetic nephropathy, dan hipertensi kronik. Proteinuria glomerular umumnya bersifat masif (>3,5 g/hari pada sindrom nefrotik) (Lamb et al., 2009).

Proteinuria Tubular

Disfungsi tubulus proksimal menyebabkan kegagalan reabsorpsi protein bermolekul kecil yang telah melewati membran glomerulus secara normal (Lamb et al., 2009). Kondisi ini dijumpai pada nekrosis tubular akut, pielonefritis kronik, sindrom Fanconi, dan nefrotoksisitas akibat obat-obatan atau logam berat (Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Proteinuria Prerenal (Overflow)

Produksi protein berat molekul rendah yang berlebihan melebihi kapasitas reabsorpsi tubulus dapat menyebabkan proteinuria meskipun fungsi ginjal normal (Strasinger & Di Lorenzo, 2014). Kondisi ini dijumpai pada mieloma multipel yang menghasilkan protein Bence Jones, hemolisis intravaskular dengan hemoglobinuria, serta mioglobinuria akibat rabdomiolisis (Dispenzieri et al., 2009; Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Proteinuria Fungsional dan Jinak

Proteinuria transien dapat terjadi akibat demam tinggi, latihan fisik berat, dehidrasi, atau posisi ortostasis berkepanjangan tanpa disertai kelainan ginjal yang mendasari (Lamb et al., 2009; Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Alat dan Bahan

Pemeriksaan protein urin metode pemanasan memerlukan alat dan bahan sebagai berikut:

Alat:

• Tabung reaksi gelas
• Pembakar Bunsen atau sumber api yang setara
• Penjepit tabung reaksi
• Pipet tetes

Bahan:

• Urin segar pasien (urin pagi hari direkomendasikan)
• Asam asetat 6%
• Larutan buffer pH 4,5 (alternatif pengganti asam asetat 6%)
• Larutan NaCl jenuh (digunakan apabila BJ urin 1,003–1,006)

Pembuatan Asam Asetat 6%:

Asam asetat glasial (CH₃COOH, kemurnian ≥99%) diambil sebanyak 6 mL, kemudian diencerkan dengan akuades hingga volume total 100 mL di dalam labu ukur. Larutan dihomogenkan, dipindahkan ke botol reagen bertutup rapat, dan diberi label tanggal pembuatan. Larutan stabil selama tiga bulan apabila disimpan pada suhu ruang (15–25 °C) terhindar dari cahaya langsung (Gandasoebrata, 1968; Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Pembuatan Larutan Buffer pH 4,5 (alternatif):

Asam asetat glasial sebanyak 56,5 mL dan natrium asetat (CH₃COONa) sebanyak 118 g dilarutkan ke dalam akuades, kemudian volume digenapkan hingga 1.000 mL. pH larutan diverifikasi menggunakan pH meter yang terkalibrasi; apabila diperlukan, pH disesuaikan dengan penambahan asam asetat glasial (untuk menurunkan pH) atau natrium asetat (untuk menaikkan pH) secara tetes demi tetes (Gandasoebrata, 1968).

Pembuatan Larutan NaCl Jenuh:

Natrium klorida (NaCl) ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam akuades pada suhu ruang sambil diaduk hingga tidak ada kristal yang dapat larut lagi (kelarutan jenuh NaCl dalam air pada 25 °C adalah sekitar 360 g/L). Larutan jenuh yang terbentuk disaring untuk memisahkan kristal yang tidak larut, kemudian disimpan dalam botol tertutup pada suhu ruang (Gandasoebrata, 1968).

Urin pagi hari merupakan spesimen yang direkomendasikan karena bersifat lebih pekat dan representatif terhadap fungsi konsentrasi ginjal semalam (Strasinger & Di Lorenzo, 2014). Pemeriksaan sebaiknya dilakukan segera setelah spesimen diperoleh; apabila penundaan tidak dapat dihindari, spesimen disimpan pada suhu 2–8 °C dan dianalisis dalam waktu tidak lebih dari empat jam (Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Prosedur Pemeriksaan

Persiapan Spesimen

Urin yang keruh disaring terlebih dahulu menggunakan kertas saring untuk menghilangkan partikel amorf yang dapat mengganggu pembacaan hasil. Apabila berat jenis (BJ) urin berkisar antara 1,003 dan 1,006, volume NaCl jenuh sebesar seperlima dari volume urin ditambahkan ke dalam tabung untuk meningkatkan kekuatan ionik larutan; modifikasi ini dilakukan khusus apabila larutan buffer pH 4,5 digunakan sebagai pengganti asam asetat 6% (Gandasoebrata, 1968).

Tahapan Prosedur

Urin dimasukkan ke dalam tabung reaksi hingga dua pertiga volume tabung. Bagian atas tabung dipanaskan di atas api Bunsen dengan memegang atau menjepit bagian bawah tabung, hingga bagian atas urin mendidih. Kekeruhan yang terbentuk pada bagian atas urin diamati dan dibandingkan dengan bagian bawah yang tidak dipanaskan sebagai kontrol kejernihan. Apabila terjadi kekeruhan, 3–5 tetes asam asetat 6% diteteskan ke dalam tabung, kemudian kekeruhan diamati kembali. Kekeruhan yang hilang setelah penambahan asam asetat mengindikasikan presipitat kalsium fosfat atau kalsium karbonat, bukan protein. Kekeruhan yang menetap atau semakin meningkat mengindikasikan adanya protein. Bagian atas tabung dipanaskan kembali hingga mendidih, kemudian derajat kekeruhan dinilai secara semikuantitatif sesuai kriteria baku (Gandasoebrata, 1968).

Penilaian Hasil Semikuantitatif

Hasil pemeriksaan dinilai secara semikuantitatif berdasarkan derajat kekeruhan yang tampak setelah prosedur pemanasan dan penambahan asam asetat (Gandasoebrata, 1968; Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Tabel 1. Kriteria penilaian hasil semikuantitatif protein urin metode pemanasan

Hasil	Deskripsi Kekeruhan	Kadar Protein Perkiraan
Negatif (−)	Tidak ada kekeruhan; urin tetap jernih	<0,01%
Positif 1+ (+)	Kekeruhan ringan tanpa butiran, hanya tampak dengan latar belakang gelap	0,01–0,05%
Positif 2+ (++)	Kekeruhan mudah dilihat, terdapat butiran halus dalam kekeruhan	0,05–0,2%
Positif 3+ (+++)	Kekeruhan jelas dengan kepingan-kepingan yang tampak nyata	0,2–0,5%
Positif 4+ (++++)	Urin sangat keruh; kekeruhan berkeping-keping atau menggumpal; bekuan solid menandakan kadar >3%	>0,5% (bekuan: >3%)

Diadaptasi dari Gandasoebrata (1968).

Interferan dan Sumber Kesalahan

Negatif Palsu (False Negative)

Penambahan asam asetat 6% yang berlebihan dapat melarutkan kembali presipitat protein halus sehingga kekeruhan tipis menghilang dan hasil terbaca negatif secara keliru (Gandasoebrata, 1968). Penyebab negatif palsu lain mencakup urin yang sangat encer (BJ <1,003) dengan kadar protein rendah di bawah ambang deteksi metode (Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Positif Palsu (False Positive)

Kekeruhan yang tidak disebabkan oleh albumin atau globulin dapat menghasilkan hasil positif palsu (Gandasoebrata, 1968). Zat-zat yang dapat menyebabkan kondisi ini meliputi nukleoprotein, musin, albumose (proteose), asam-asam resin, dan protein Bence Jones. Protein Bence Jones memiliki sifat khas: larut kembali pada pemanasan di atas 60 °C dan mengendap kembali saat didinginkan, berbeda dari albumin yang mengendap secara permanen setelah denaturasi termal (Gandasoebrata, 1968; Dispenzieri et al., 2009).

Keterbatasan Metode

Metode pemanasan dengan asam asetat memiliki sensitivitas yang lebih rendah dibandingkan metode turbidimetri atau imunoassay kuantitatif, sehingga proteinuria ringan (<0,01%) dapat luput terdeteksi (Lamb et al., 2009). Metode ini juga tidak bersifat spesifik terhadap albumin; protein lain seperti globulin, mukoprotein, dan protein Bence Jones turut memberikan reaksi positif (Gandasoebrata, 1968). Kuantifikasi protein urin yang presisi memerlukan metode fotometri atau imunoassay yang tersedia pada analisator otomatis modern (Lamb et al., 2009; Strasinger & Di Lorenzo, 2014).

Referensi

1. Dispenzieri A, Kyle R, Merlini G, et al. International Myeloma Working Group guidelines for serum-free light chain analysis in multiple myeloma and related disorders. Leukemia. 2009;23(2):215–224.
2. Gandasoebrata R. Penuntun Laboratorium Klinik. Jakarta: Dian Rakyat; 1968.
3. Lamb EJ, MacKenzie F, Stevens PE. How should proteinuria be detected and measured? Ann Clin Biochem. 2009;46(3):205–217.
4. Strasinger SK, Di Lorenzo MS. Urinalysis and Body Fluids. 6th ed. Philadelphia: F.A. Davis Company; 2014.
5. Tencer J, Torffvit O, Grubb A, et al. Proteinuria selectivity index based upon alpha 2-macroglobulin is superior to the IgG based index in differentiating glomerular diseases. Kidney Int. 1998;54(6):2098–2105.