Menghitung Jumlah Sel Trombosit Metode Visual Hemositometer

Berbagi
Print
Pendahuluan

Hitung jumlah trombosit sangat membantu dalam mendiagnosis gangguan perdarahan. Fungsi trombosit terutama dalam hemostasis (penghentian perdarahan) dan dalam menjaga integritas kapiler (cedera pada dinding kapiler disumbat oleh trombosit untuk menghambat perdarahan dan untuk mempertahankan fungsi penyegelan dinding kapiler). Nilai normal untuk jumlah trombosit adalah 150.000 sampai 400.000 /uL (150 hingga 400X109 / L).

Peningkatan jumlah trombosit atau disebut dengan trombositosis, ditemukan pada polycythemia vera, idiopathic thrombocythemia, chronic myelogenous leukemia dan setelah splenektomi. Penurunan jumlah trombosit atau disebut dengan trombositopenia, terjadi pada thrombocytopenia purpura, aplastic anemia, acute leukemia, Gaucher's disease, pernicious anemia dan kadang-kadang setelah kemoterapi dan terapi radiasi. Waktu perdarahan yang lama dan retraksi bekuan bisa terjadi karena trombositopenia.

Trombosit agak sulit untuk dihitung. Karena ukurannya yang kecil, mudah hancur, dan sulit dibedakan dari kotoran. Mudah melekat satu sama lain (agregasi) dan mudah melekat pada benda asing (daya merekat). Pada sampel darah untuk hitung jumlah trombosit dapat menggunakan EDTA sebagai antikoagulan untuk membantu mengurangi penggumpalan platelet, tetapi mean platelet volume (MPV) akan meningkat selama satu jam pertama di dalam tabung. Meskipun MPV akan relatif stabil selama 8 jam ke depan, yang terbaik adalah mengukur MPV pada 1 sampai 3 jam setelah spesimen diperoleh.

Trombosit bisa semakin membesar karena perubahannya dari bentuk cakram menjadi bentuk bola. Meskipun darah ujung jari (atau tumit) dapat digunakan, hasilnya sering kurang memuaskan dan secara signifikan lebih rendah daripada jumlah trombosit yang dilakukan pada darah vena (Sejumlah kecil trombosit mungkin hilang saat dilakukan penusukan). Jika terpaksa mengunakan spesimen ujung jari atau tumit, tetesan darah kecil pertama setelah tusukan harus dibuang. Sampel untuk hitung trombosit rangkap dua, dari setetes darah yang mengalir bebas. Darah tidak boleh berada di tempat tusukan dan harus masuk ke pipet pengencer secepat darah mengalir dari luka untuk mencegah penggumpalan atau adhesi platelet ke tempat tusukan.

Hitung jumlah trombosit ada dua metode umum. Penghitung sel otomatis dan menghitung trombosit manual menggunakan hemositometer. Pada artikel ini akan membahas tentang metode manual. Prinsip hitung jumlah trombosit secara manual adalah sampel darah diencerkan dengan amonium oksalat 1%, yang menyebabkan sel darah merah lisis. Trombosit kemudian dihitung, menggunakan hemositometer menggunakan mikroskop. Hasilnya diperiksa ulang dengan pemeriksaan trombosit pada apusan yang diwarnai Wright atau Giemsa.

Prinsip dari pemeriksaan ini adalah Sampel darah diencerkan dengan 1% amonium oksalat, yang melisiskan sel darah merah. Trombosit kemudian dihitung, menggunakan hemositometer dan mikroskop. Hasilnya diperiksa ulang dengan pemeriksaan trombosit pada apusan yang diwarnai Wright.

Larutan Pengencer
Cairan Brecher-Cronkite: Terdiri dari 1% larutan amonium oksalat yang disaring dan disimpan pada suhu 4°C.

Rees-Ecker
BahanBanyaknyaFungsi
Sodium citrate3,8 gMencegah koagulasi
Brilliant cresyl blue 50 mgPewarna trombosit
Formalin0,2 ml
Aquadest100 mL

Prosedur
Persiapan alat dan bahan sebelum memulai pemeriksaan yaitu reagen Amonium oksalat, 1% (yang diencerkan dengan aquadest) Simpan di lemari es dan saring sebelum digunakan. Hemositomer (paket ada bilik hitung, pipet lekosit dan pipet eritrosit). Deck glass sekali pakai yang tipis, Objeck glass (preparat bersih kering), pewarna Wright, mikroskop, cawan petri, kertas saring.

Langkah kerja
  1. Campurkan darah dengan lembut selama kurang lebih 2 menit sebelum melakukan pemeriksaan. Kemudian priksa tabung dari gumpalan. Jika ada, sampel harus diganti. Buat sediaan apusan darah yang nanti untuk dilakukan pewarnaan Wright.
  2. Gunakan pipet Thoma RBC (pipet eritrosit), buat penenceran 100x ambil darah hingga tanda 1.0, dan encerkan hingga 101 garis dengan 1% ammonium oxalate. Siapkan pengenceran dalam rangkap dua. Dalam beberapa refensi ada juga menyarankan memakai pengenceran 200x namun disini penenceran 200x digunakan jika terjadi kenaikkan jumlah sel trombosit. Campur sampel darah yang diencerkan selama 10 sampai 15 menit.
  3. Bersihkan hemositometer secara menyeluruh dan pastikan benar-benar bebas dari semua kotoran dan serat. Penggunaan etil alkohol 95% (v/v) dan kain tidak berbulu direkomendasikan untuk proses pembersihan.
  4. Siapkan wadah lembab sebagai berikut: ambil cawan petri dan selembar kertas saring yang diameternya kira-kira sama dengan cawan petri. (Bisa digunakan bagian atas atau bawah cawan.) Basahi kertas saring secara menyeluruh dan letakkan di cawan petri agar menempel ke cawan.
  5. Jika sampel darah yang diencerkan sudah tercampur dengan baik, isi satu sisi ruang hitung atau keduannya dengan sampel yan sudah diencerkan. Kemduian letakkan hemositometer diruang lembab dan diamkan sediaan selama 15 sampai 20 menit. Ini memberikan waktu bagi trombosit untuk mengendap, dan tutup cawan petri untuk mencegah penguapan cairan di ruang hitung.
  6. Letakkan hemositometer pada meja mikroskop. Fokuskan pada kotak tengah besar hemositometer dengan daya rendah (10X). Selanjutnya ubah dengan hati-hati ke perbesaran 40x. Trombosit tampak seperti tubuh bulat atau oval dengan kilau keunguan terang. Saat memfokuskan ke atas dan ke bawah dengan pengatur halus, trombosit mungkin terlihat di beberapa fokus dan seperti kilauan. Kotoran dan puing-puing dibedakan dengan daya pantulnya yang tinggi.
  7. Hitung trombosit dalam 25 kotak kecil (ada yang menyarankan 10 kotak ada juga 12.5 kotak kecil). Kotak yang disarankan untuk digunakan adalah yang diberi label T pada ilustrasi. Bisa hitung kedua sisi bilik hitun untuk menentukan jumlah rata-rata trombosit yang dihitung. Rumus sederhana perhitun trombosit pada bilik hitung Hitung hemositometer:

Perhitungan :
\[ = {N \over V} \times P\]
\[ = \frac{Jumlah \ Sel}{Jumlah \ kotak \times \ (panjang \times lebar \times tinggi)} \times Pengenceran \]
\[ = \frac{N}{25 \times \ (0,2 \times 0,2 \times 0,1)} \times 100 \]
\[ = \frac{N}{25 \times \ 0,004} \times 100 \]
\[ = \frac{N}{0,1} \times 100 = \frac{N}{1 \over 10} \times 100 \]
\[ = N \times {10 \over \cancel{1}^1} \times {\cancel{100}^{100} \over 1} = N \times 10 \times 100 \]
\[ = N \times 1000 \]

Catatan :
Jika konsentrasi antikoaulan EDTA melebihi 2 mg/mL darah, trombosit dapat membengkak dan kemudian pecah, menyebabkan jumlah yang lebih tinggi secara tidak valid.

Darah harus diencerkan dalam 5 jam setelah pengambilan sampel, atau dalam 24 jam jika darah telah disimpan pada suhu lemari es. Setelah darah diencerkan dengan 1% amonium oksalat, pengenceran stabil setidaknya selama 8 jam.

Hemositometer dan pipet harus benar-benar bersih dan cairan pengencernya harus disaring baru. Harus ada distribusi trombosit yang merata di ruang hitung.

Jika gumpalan trombosit dicatat dalam jumlah trombosit, prosedur dapat diulangi karena hal ini mungkin disebabkan oleh pencampuran yang tidak memadai. Jika teknik yang buruk digunakan dalam memperoleh sampel darah, sampel harus diganti. Sebagai alternatif, sampel baru dapat diperoleh dengan menggunakan 0,109 M natrium sitrat sebagai antikoagulan. Jika natrium sitrat digunakan, hasil akhir harus dikalikan dengan 1,1 untuk mengoreksi pengenceran darah dalam antikoagulan.

Jika kurang dari 80 trombosit dihitung dalam 10 kotak kecil, atau dihitung di kotak tengah besar (25 kotak kecil) di kedua sisi hemositometer harus dihitung. Jika kurang dari 50 trombosit dihitung per sisi. Hitung jumlah trombosit dapat diulang, menggunakan penenceran sampel darah 1:20 menggunakan thoma leukosit. Untuk hasil terbaik, minimal 100 trombosit harus dihitung. Jika jumlah trombosit sangat tinggi, pengenceran 1: 200 dapat dilakukan, menggunakan pipet Thoma eritrsoit.

Selain mengunakan ammonium oxlate 1% kita juga bisa mengunakan pengencer Rees-Ecker dan dalam referensi yang dituliskan oleh Barara brown disarankan jika kita mengunakan mikroskop cahaya yang terang. Selain itu jua dapat menggunakan larutan pengencer Dacie’s seperti pada perhitungan sel eritrosit.

Prosedur hitung trombosit mengunakan Rees-Ecker dengan menggunakan pewarna brilliant cresyl blue. Cairan pengencer ini harus disaring sebelum digunakan. Ikuti prosedur seperti yang dijelaskan di atas untuk pengenceran dan menghitung. Cairan pengencer ini tidak akan menyebabkan hemolisis sel darah merah. Pada mikroskop cahaya terang, trombosit tampak sebagai partikel kecil, bulat, oval, dan diwarnai kebiruan terang. Berhati-hatilah agar tidak membingungkan trombosit dengan kotoran. Dengan menggunakan cairan pengencer ini, jumlah trombosit harus diselesaikan dalam waktu 30 menit setelah pengenceran untuk memastikan tidak terjadi disintegrasi trombosit.

Sumber Kesalahan, dapat terjadi jika trombosit menggumpal, sebaiknya jangan lakukan penghitungan trombosit. Selalu bandingkan penghitungan dengan apusan tepi, maka dari itu pada langkah kerja kita membuat apusan darah tepi dan diwarnai dengan pengecatan Wright, alternatif lain bisa menggunakan pewarnaan Giemsa.

Sumber Kesalahan peralatan pipet dan ruang Neubauer yang tidak akurat. Pengumpulan darah yang tidak tepat atau pencampuran sampel darah yang tidak tepat. Kesalahan manusia juga bisa terjadi karena pengisian ruang Neubauer atau bilik hitung yang tidak tepat.

Nilai Normal

150,000-400,000 / μl

Ilustrasi

Video
Maaf untuk untuk saat ini belum ada video
Pustaka
  1. Barbara A. Brown, 1993, Hematology : principles and procedures Sixth Edition, Lea & Febiger, Philadelphia, London
  2. Barbara H. Estridge and Anna P. Reynolds, 2012, Basic Clinical Laboratory Techniques Sixth Edition, Delmar, Cengage Learning
  3. Ramadas Nayak, Sharada Rai, Astha Gupta, 2012, Essentials in Hematology and Clinical Pathology, Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd., New Delhi.
  4. Harsh Mohan, 2013,Pathology Practical Book, Third Edition, Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd., New Delhi.
  5. Gandasoebrata, 1968, Penuntun Laboratorium Klinik, Dian Rakyat, Jakarta.

Tidak ada komentar:

Posting Komentar