Pengecatan Preparat Apusan Darah Metode Giemsa

Berbagi
Print
× Info! Artikel ini sudah diperbaharui pada tanggal 18 Juni 2021.
Pendahuluan

Pengecatan atau pewarnaan Giemsa merupakan pewarnaan Romanowsky yang merupakan pewarnaan standar digunakan di laboratorium hematologi untuk pewarnaan rutin apusan darah tepi dan pewarnaan sumsum tulang. Berbagai macam pewarna Romanowsky selain Giemsa yaitu May-Gruenwald, Leishman, Wright, dan Jenner. Giemsa adalah pewarna polikromatik serbaguna, yang cocok untuk pewarnaan beragam spesimen. Pada awal 1900-an, Gustav Giemsa merancang pewarnaan Giemsa untuk mendeteksi parasit seperti malaria dan Treponema pallidum pada apusan darah. Gustav Giemsa bekerja sebagai ahli kimia, dan meninggal pada tahun 1948. Metode pewarnaan, yang menggunakan namanya, dirancang terutama untuk demonstrasi parasit pada malaria, tetapi juga digunakan dalam histologi karena pewarnaan kromatin dan membran inti berkualitas tinggi, metakromasia beberapa komponen seluler, dan kualitas pewarnaan sitoplasma yang berbeda tergantung pada jenis selnya. Dia mengembangkan proses oksidasi menggunakan campuran methylene azure, methylene blue, dan eosin, dengan gliserol ditambahkan sebagai zat penstabil.

Mikroorganisme seperti Histoplasma, Leishmania, Toxoplasma, dan Pneumocystis juga dapat dideteksi dengan Giemsa, dan di jaringan lambung, Helicobacter pylori (H. pylori) tampak tipis dan berwarna biru. Pewarnaan Giemsa sering digunakan untuk tujuan diagnostik dalam hematologi untuk membedakan morfologi nukleus dan sitoplasma dari trombosit, sel darah merah, sel darah putih, dan parasit. Pewarnaan Giemsa sering digunakan dalam kombinasi dengan larutan pewarna lain yaitu May-Grünwald untuk Pappenheim (MGG) dan Wright-Giemsa. Pewarnaan yang dihasilkan dapat bervariasi tergantung pada pengaruh fiksasi, waktu pewarnaan, dan nilai pH larutan atau buffer.

Seperti yang sudah dijelaskan diatas sebelumnya bahwa pewarnaan Giemsa dapat diadaptasi ke histologi karena pewarnaan unik kromatin, membran inti, dan elemen sitoplasma. Pewarnaan yang diperoleh di bagian jaringan lebih bervariasi daripada di apusan karena diperlukan langkah yang berbeda (diferensiasi, dehidrasi, pembersihan). Warna berbagai komponen seluler dipengaruhi oleh perlakuan awal bahan spesimen. Bahan sitologi klinis seperti sedimen urin, dahak, apusan dari fine-needle aspiration biopsies (FNAB).

Bidang sitogenetik diperluas dengan penemuan bahwa kromosom metafase yang dicerna dengan tripsin dapat diwarnai dengan Giemsa untuk mengungkapkan daerah kaya AT dan kaya GC (pola pita G). Keuntungan unik dari pewarnaan Giemsa juga dimanfaatkan untuk menetapkan klasifikasi Kiel limfoma karena pewarnaan preferensial pada jaringan hematolimfoid. Poster ini menunjukkan keserbagunaan pewarnaan Giemsa karena penggunaannya dalam berbagai aplikasi, termasuk hematologi, histologi, sitologi, bakteriologi, dan sitogenetika.

Prinsip dari pewarnaan Giemsa adalah untuk membedakan morfologi nukleus dan atau sitoplasma dari trombosit, sel darah merah, sel darah putih, dan parasit. Pewarnaan yang paling dapat diandalkan untuk parasit darah, terutama pada preparat darah tebal, Giemsa yang sering diapaki adalah yang mengandung azure B, atau yang sudah sesuai standar dari Biological Stain Commission. Pewarnaan harus diencerkan untuk digunakan dengan buffer air hingga pH 6,8 atau 7,0 hingga 7,2, tergantung pada teknik khusus yang digunakan. Keduanya harus diuji untuk reaksi pewarnaan yang tepat sebelum digunakan. Stok stabil selama bertahun-tahun, tetapi harus dilindungi dari kelembaban karena reaksi pewarnaan bersifat oksidatif. Oleh karena itu, oksigen dalam air akan memulai reaksi dan merusak stock stain. Pengenceran noda dalam air hanya baik untuk 1 hari.

Pembuatan larutan Stock Giemsa :
Untuk membuat 500 mL Giemsa, bahan yang dibutuhkan adalah:
  • Bubuk Giemsa, 3,8 g (dengan kualitas standar Biological Stain Commission)
  • Metanol absolut, murni, bermutu tinggi, bebas aseton, 250 mL
  • Gliserol, kualitas tinggi, murni, 250 mL
  • Manik-manik kaca padat yang dibersihkan dengan metanol, diameter 3–5 mm, 50-100 buah
  • Spatula atau sendok takar
  • Kertas untuk menimbang
  • Gelas ukur
  • Gelas atau corong plastik
  • Botol kaca dengan tutup ulir, gelap atau kuning, bersih dan kering, kapasitas 500 mL (Jika tidak tersedia, kaca keras bening yang bersih secara kimiawi, kering, bening atau botol polietilen dengan ukuran yang sesuai dapat digunakan, tetapi harus dibungkus dalam kertas gelap); Timbangan analitik yang mampu menimbang hingga 0,01 g dan
  • Pengocok (shacker), jika tersedia.
Langkah pembuatan
  1. Tempatkan sekitar 50 manik-manik kaca yang telah dibersihkan metanol ke dalam botol gelap atau kuning.
  2. Timbang 3,8 g bubuk noda Giemsa pada timbangan analitik, dan tuangkan ke dalam botol berisi manik-manik melalui corong.
  3. Tuangkan dengan hati-hati sekitar 100 mL metanol, pastikan semua noda kering dicuci ke dalam botol.
  4. Kencangkan tutup sekrup pada botol. dan kocok dengan gerakan memutar selama 2-3 menit untuk mulai melarutkan kristal noda.
  5. Tambahkan 250 mL gliserol ke dalam campuran melalui corong, dan kocok lagi selama 3–5 menit.
  6. Tambahkan sisa 150 mL metanol ke dalam campuran melalui corong, pastikan bahwa metanol terakhir mencuci gliserol terakhir dari corong ke dalam campuran noda.
  7. Kencangkan tutup botol.
  8. Lanjutkan mengocok selama 2-3 menit masing-masing sekitar enam kali pada hari pertama.
  9. Kocok setiap hari selama 2-3 menit masing-masing sekitar enam kali selama minimal 7 hari. Pengocok dapat digunakan, jika tersedia.
  10. Beri label botol secara jelas dengan nomor batch, nama orang yang menyiapkan stok, tanggal pembuatan, dan tanggal kadaluwarsa, dan dokumen dalam buku catatan kendali mutu.
  11. Kencangkan tutup botol untuk mencegah penyerapan uap air dari udara, dan simpan di tempat yang sejuk jauh dari sinar matahari langsung.
Catatan
  • Botol harus ditutup rapat setiap saat untuk mencegah penyerapan uap air dan untuk menghindari penguapan dan oksidasi noda oleh kelembaban tinggi. Jika tutup botol tertutup rapat dan bebas dari kelembapan, noda Giemsa akan stabil pada suhu kamar lebih lama.
  • Simpan dalam botol kaca gelap di tempat yang sejuk, kering, teduh, jauh dari sinar matahari langsung. Jika botol stok bening digunakan, bungkus dengan kertas gelap tebal untuk menghindari penetrasi cahaya.
  • JANGAN mengocok stok botol Giemsa setidaknya selama 24 jam sebelum digunakan untuk menghindari endapan yang tersuspensi kembali, yang akan mengendap pada lapisan darah selama pewarnaan dan mengaburkan detail penting selama pengamatan mikroskopi.
  • JANGAN mencemari larutan stok Giemsa dengan air; air sekecil apa pun akan menyebabkan noda semakin rusak, membuat pewarnaan semakin tidak efektif.
  • Untuk kebutuhan harian, ukur dan saring sejumlah kecil noda ke dalam botol yang tertutup rapat (sekitar 25–50 mL), sehingga larutan stok kecil kemungkinannya terkontaminasi.
  • JANGAN memasukkan atau menggunakan pipet basah atau kotor ke dalam larutan stok Giemsa.
  • JANGAN mengembalikan noda yang tidak terpakai atau sisa ke botol stok atau ke botol yang berisi larutan yang berfungsi; noda yang keluar dari botol harus segera digunakan atau dibuang.


Tabel Pembuatan Phosphate buffer
pHNa2HPO4 (9.3 g/liter, anhydrous)NaH2PO4 · H2O,(9.2 g/liter)Aquadest
6.637.562.5900
6.850.449.6900
7.038.961.1900
7.228.072.0900

Prosedur
Persiapan alat dan bahan yaitu pewarna Giemsa sesuai kebutuhan dan konsentrasi atau perandingan yang dipakai sesuai SOP yang ada misalnya jika kita memakai Giemsa stock pabrikan ada yang menyarankan 1:20 untuk membuat larutan kerja, sedankan standar WHO dalam pewarnaan preparat malaria bisa menggunakan konsentrasi 3% atau 10%. buffer pH 6,2, 6,8 atau 7,2, pipet dan rak pengecatan.

Langkah kerja
Prosedur dalam hematologi pertama menyiapkan preparat apusan darah tipis, letakkan pada rak pengecatan biarkan kering udara. Kemudian fiksasi dengan larutan metanol selama 3 menit. Tambahkan larutan Giemsa pada preparat secukupnya, diamkan selama 20 menit. Langkah selanjutnya bilas dengan buffer selama 1 menit kemudian cuci dengan aquadest atau air mengalir selama 2 menit. Keringkan di antara kertas saring periksa di bawah mikroskop atau awetkan dengan memasang deckglass di beri larutan canada balsam. Preparat apusan darah kering dapat disimpan selama beberapa minggu tanpa merusak sifat pewarnaannya. Film yang sudah lebih dari sebulan mungkin tidak akan memberikan hasil yang baik.

Sedangkan dalam parasitologi terutama pemeriksaan malaria menurut WHO dari giemsa stock dibuat konsetrasi sesuai kebutuhan dilapangan jika kita tidak terburu-buru maka gunakan konsentrasi 3% tetapi jika kita memutuhkan waktu singkat bisa menggunakan konsentrasi 10%. Pertama siapkan preparat malaria tebal tipis, kemudian fiksasi metanol selama 2 menit untuk preparat darah tipis (jika dalam satu preparat tebal tipis maka hanya darah tipis saja yang difiksasi). Setelah itu genangi prparat dengan larutan Giemsa, jika menunakan larutan Giemsa 10% biarkan selama 8-10 menit sedangkan pada konsetrasi 3% biarkan selama 45-60 menit. Buang cat Giemsa pada preparat kemudian bilas dengan buffer secukupnya kemdian bersihkan dengan air mengalir, biarkan kering udara.

SelHasil
Eritrositkemerahan
Inti selUngu
EosinofilButiran: Merah sampai merah coklat
BasofilButiran: Ungu tua
LimfositSitoplasma biru
MonositSitoplasma abu-abu biru
Trombositungu
Parasit darahInti merah


Ilustrasi

Video


Maaf untuk untuk saat ini belum ada video


Pustaka
  1. Barcia, J. J. (2007). The Giemsa Stain: Its History and Applications. International Journal of Surgical Pathology, 15(3), 292–296. https://doi.org/10.1177/1066896907302239
  2. Brown BA: Hematology: Principles and Procedures 6th ed.. Philadelphia. Lea and Febiger. 1993. pp. 144-160
  3. Merckmillipore, 2021, Giemsa Stain for Microscopy - Giemsa Staining Protocols, Merck KGaA, Darmstadt, Germany. URL : https://www.merckmillipore.com/ID/id/ivd-oem-materials-and-reagents/learning-center/giemsa-solution/r2ab.qB.aBwAAAFOqm81lSAJ,nav?RedirectedFrom=%2Fgiemsa-solution&bd=1
  4. WWHO, 2016, Malaria microscopy standard operating procedures, World Health Organization. Regional Office for the Western Pacific. URL :http://iris.wpro.who.int/handle/10665.1/14214/

3 komentar :