Pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZN)

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZN) merupakan salah satu metode yang paling penting dan banyak digunakan untuk deteksi Bakteri Tahan Asam (BTA), khususnya Mycobacterium tuberculosis, penyebab penyakit tuberkulosis. Metode pewarnaan ini menjadi landasan utama diagnosis tuberkulosis di daerah dengan sumber daya terbatas karena kesederhanaan, efektivitas biaya, dan kemampuannya memberikan hasil awal dengan cepat. Teknik ZN memanfaatkan komposisi unik dinding sel mikobakteria, yang mengandung banyak lipid (asam mikolat) yang tahan terhadap dekolorisasi oleh asam-alkohol setelah diwarnai dengan pewarna tertentu.

Tujuan

Tujuan utama teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen adalah:

1. Mengidentifikasi bakteri tahan asam dalam spesimen klinis
2. Membantu diagnosis infeksi mikobakterial, khususnya tuberkulosis
3. Memantau respon pasien terhadap terapi antimikobakterial
4. Menentukan prosedur pengendalian infeksi yang tepat
5. Menentukan pengenceran sedimen yang sesuai untuk pengujian kepekaan obat
6. Mengkonfirmasi keberadaan bakteri tahan asam dalam kultur

Prinsip

Metode pewarnaan Ziehl-Neelsen didasarkan pada prinsip bahwa mikobakteria memiliki dinding sel yang kaya akan asam mikolat, yang membuatnya sulit diwarnai menggunakan metode konvensional seperti pewarnaan Gram. Kandungan lipid yang tinggi pada dinding sel mencegah pewarna meresap dengan mudah. Prinsip metode ZN meliputi:

1. Menggunakan panas untuk membantu karbol fuksin menembus dinding sel berlilin mikobakteria
2. Dinding sel mikobakterial mempertahankan pewarna karbol fuksin merah bahkan setelah dekolorisasi dengan asam-alkohol
3. Organisme non-tahan asam kehilangan pewarna primer ketika diberi asam-alkohol dan mengambil pewarna tandingan (metilen biru atau hijau brilian)
4. Hal ini menghasilkan bakteri tahan asam tampak merah terhadap latar belakang biru atau hijau

Persiapan Bahan Reagen

Bahan yang Diperlukan
1. Alat Persiapan Sediaan:

• Kaca sediaan frosted-end (baru, bersih, tidak pernah digunakan ulang)
• Bambu lidi yang ujungnya dipipihkan
• Tusuk gigi untuk meratakan spesimen
• Bunsen atau lampu spiritus
• Pensil 2B untuk pelabelan
• Wadah limbah kecil berisi disinfektan
• Jas laboratorium dengan bukaan belakang dan manset elastis
• Masker dan sarung tangan
• Pinset
• Disinfektan (Lysol 5%, alkohol 70%, hipoklorit 0,5%)
• Wadah limbah infeksius

2. Peralatan Pewarnaan:

• Rak pewarnaan
• Pinset kayu
• Air mengalir atau botol semprot
• Lampu spiritus
• Kain basah
• Rak pengering
• Pengatur waktu
• Kertas saring dan corong

3. Reagen ZN:

• Karbol Fuksin 1% (ZN A)
• Asam-Alkohol 3% (ZN B)
• Metilen Biru 0,1% (ZN C)

Spesifikasi Reagen

Kit pewarnaan ZN lengkap terdiri dari:

• Satu botol Karbol Fuksin 1% (100ml)
• Tiga botol Asam-Alkohol 3% (100ml masing-masing)
• Satu botol Metilen Biru 0,1% (100ml)

Reagen harus disimpan dalam botol kaca gelap dengan tutup berulir dan harus diberi label dengan warna berbeda (merah untuk Karbol Fuksin, putih untuk Asam-Alkohol, dan biru untuk Metilen Biru). Kit harus disimpan jauh dari sinar matahari langsung, dan reagen memiliki umur simpan maksimal satu tahun dari tanggal pembuatan.

Prosedur

Pembuatan Sediaan

1. Pipihkan ujung lidi bambu menggunakan tang untuk menciptakan ujung berserabut
2. Pilih bagian purulen (kental berwarna kuning kehijauan) dari sampel dahak menggunakan lidi bambu yang telah dipipihkan
3. Sebarkan spesimen pada kaca sediaan bersih dalam bentuk oval berukuran sekitar 2×3cm
4. Ratakan menggunakan tusuk gigi dengan gerakan spiral kecil sampai kering
5. Buang lidi dan tusuk gigi bekas ke dalam wadah berisi disinfektan
6. Setelah kering, fiksasi sediaan dengan melewatkannya melalui api 2-3 kali menggunakan pinset
7. Pastikan apusan menghadap ke atas

Prosedur Pewarnaan Ziehl-Neelsen

1. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan jarak sekitar 1 lebar jari (2-3cm) di antara sediaan
2. Teteskan Karbol Fuksin 1% melalui corong yang dilapisi kertas saring, mulai dari tepi sediaan hingga menutupi seluruh permukaan
3. Panaskan sediaan hingga mengeluarkan uap (jangan sampai mendidih) menggunakan lampu spiritus, kemudian biarkan selama minimal 10 menit
4. Padamkan api menggunakan kain yang dibasahi
5. Bilas sediaan perlahan dengan air mengalir, hati-hati jangan mengarahkan air langsung ke apusan
6. Buang kelebihan air dari sediaan
7. Teteskan Asam-Alkohol 3% pada sediaan dan biarkan selama 3 menit, kemudian bilas dengan air sampai bersih tanpa warna merah yang tersisa
8. Jika warna merah masih terlihat, ulangi dekolorisasi sekali lagi
9. Teteskan pewarna tandingan Metilen Biru 0,1% untuk menutupi seluruh sediaan dan biarkan selama 1 menit
10. Bilas dengan air mengalir
11. Keringkan sediaan pada rak pengering, dan sediaan siap untuk diperiksa

Pembacaan Hasil

Pemeriksaan Mikroskopis

1. Gunakan objektif 10× untuk menemukan dan memfokuskan pada sediaan
2. Teteskan satu tetes minyak imersi pada apusan, berhati-hati agar dropper tidak menyentuh apusan
3. Putar ke objektif 100×
4. Periksa sediaan secara sistematis dari kiri ke kanan sepanjang sumbu horizontal terpanjang, minimal 100 lapang pandang
5. Hitung jumlah BTA yang ditemukan dari kiri ke kanan
6. Interpretasikan hasil sesuai dengan skala IUATLD

Interpretasi Skala IUATLD

Interpretasi Hasil	Jumlah BTA yang Ditemukan	Format Pelaporan
Negatif	Tidak ditemukan BTA minimal dalam 100 lapang pandang	Neg (tidak ditulis sebagai "-")
Scanty	1-9 BTA dalam 100 lapang pandang (Tuliskan jumlah BTA yang ditemukan)	misalnya "2 bta", "4 bta"
1+	10-99 BTA dalam 100 lapang pandang	1+
2+	1-10 BTA setiap 1 lapang pandang (periksa minimal 50 lapang pandang)	2+
3+	≥10 BTA setiap 1 lapang pandang (periksa minimal 20 lapang pandang)	3+

Catatan: Hasil negatif ditulis dengan tinta hitam atau biru, sedangkan hasil positif dan scanty ditulis dengan tinta merah.

Pelaporan Hasil

1. Catat hasil pemeriksaan pada Register Lab (TBC 04) dan beri nomor register lab
2. Catat hasil pemeriksaan pada Form TBC 05
3. Beri tanggal dan tandatangani Form TBC 05
4. Untuk hasil positif dengan hitungan BTA, laporkan sebagai "Positif untuk bakteri tahan asam" beserta grading yang sesuai (1+, 2+, 3+ atau hitungan yang tepat untuk hasil scanty)
5. Untuk hasil negatif, laporkan sebagai "Negatif untuk bakteri tahan asam"

Kelebihan dan Kekurangan

Kelebihan

• Metode sederhana dan hemat biaya untuk skrining TB
• Membutuhkan peralatan minimal dan dapat dilakukan di daerah dengan sumber daya terbatas
• Memberikan hasil awal dengan cepat untuk pengelolaan pasien
• Membantu pemantauan efektivitas pengobatan
• Membantu pengambilan keputusan pengendalian infeksi
• Metode yang telah mapan dan terstandarisasi dengan spesifisitas yang baik

Kekurangan

• Sensitivitas terbatas (22-78% dibandingkan dengan kultur)
• Membutuhkan minimal 5.000-10.000 basil per ml dahak untuk deteksi
• Tidak dapat membedakan M. tuberculosis dari mikobakteria lainnya
• Tidak spesifik hanya untuk mikobakteria; organisme lain seperti Nocardia, Rhodococcus, dan Legionella micdadei juga dapat bersifat tahan asam
• Mikobakteria yang tumbuh cepat mungkin bervariasi tahan asam atau bahkan negatif
• Membutuhkan banyak tenaga dan waktu
• Membutuhkan personel terlatih untuk interpretasi yang akurat

Catatan

Penyimpanan Sediaan

1. Hilangkan minyak imersi dengan menekan kertas tisu pada permukaan sediaan, kemudian celupkan sediaan ke dalam wadah berisi xylol/xylene dan biarkan mengering
2. Simpan sediaan dalam kotak sediaan secara berurutan sesuai dengan nomor registrasi lab

Kualitas Sediaan yang Baik

Sediaan dahak yang berkualitas baik harus memenuhi enam kriteria:

1. Kualitas spesimen (harus mengandung leukosit atau makrofag)
2. Ukuran apusan yang sesuai (2×3 cm)
3. Ketebalan yang tepat (tidak terlalu tebal atau tipis)
4. Kerataan (tidak ada area kosong)
5. Pewarnaan yang tepat (kontras yang baik antara BTA dan latar belakang)
6. Kebersihan (tidak ada endapan kristal atau residu pewarna)

Troubleshooting Masalah Umum

Hasil Positif Palsu

• Menggunakan sediaan bekas
• Kontaminasi silang antara sediaan positif dan negatif
• Partikel makanan yang keliru dianggap BTA
• Endapan pewarna
• Minyak imersi yang terkontaminasi

Hasil Negatif Palsu

• Sediaan yang terlalu tebal atau tidak bersih
• Ukuran apusan yang tidak tepat
• BTA yang buruk pewarnaannya
• Suhu yang tidak tepat selama pewarnaan
• Pemeriksaan sediaan yang tidak lengkap

Kesimpulan

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen tetap menjadi alat penting dalam diagnosis dan pengelolaan tuberkulosis, terutama di daerah dengan sumber daya terbatas. Meskipun memiliki keterbatasan dalam sensitivitas dibandingkan dengan kultur atau metode molekuler, kesederhanaannya, efektivitas biaya, dan kemampuannya memberikan hasil cepat menjadikannya komponen penting program pengendalian TB di seluruh dunia. Teknik yang tepat dalam persiapan apusan, pewarnaan, dan interpretasi sangat penting untuk hasil yang akurat. Bila dilakukan dengan benar, pewarnaan ZN memberikan informasi berharga untuk diagnosis, pemantauan pengobatan, dan pengendalian infeksi, berkontribusi secara signifikan terhadap upaya global untuk memerangi tuberkulosis.

Referensi

1. Kent PT, Kubica GP. (1985). Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control, Atlanta, GA.
2. Salfinger M, Pfyffer GE. (1994). The new diagnostic mycobacteriology laboratory. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13:961–979.
3. Centers for Disease Control and Prevention. (2009). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th ed. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA.
4. Ebersole LL. (1992). Acid-fast stain procedures. In Isenberg HD (ed), Clinical Microbiology Procedures Handbook, vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, DC.
5. International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases (IUATLD). Pedoman teknis untuk mikroskopi tuberkulosis.
6. Pfyffer G. (2015). Mycobacterium: General Characteristics, Laboratory Detection, and Staining Procedures. In Manual of Clinical Microbiology, 11th Edition. ASM Press, Washington, DC.
7. Daniel, TM. (1990). The rapid diagnosis of tuberculosis: a selective review. J Lab Med 116:277–282.
8. KEMENKES. (2022). Petunjuk Teknis Pemeriksaan Mikroskopis Tuberkulosis. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.