Pewarnaan Congo Red (Congo Red Stain)

Amyloidosis mencakup kelompok kompleks gangguan protein misfolding yang ditandai oleh deposisi ekstraseluler protein fibrilar yang tidak larut di berbagai jaringan dan organ. Agregat protein abnormal ini, yang disebut amyloid, memiliki struktur sekunder β-pleated sheet yang sama meskipun berasal dari protein prekursor yang berbeda. Signifikansi klinis amyloidosis tidak dapat diabaikan, karena deposit ini dapat sangat mengganggu fungsi organ dan menyebabkan komplikasi yang mengancam jiwa yang mempengaruhi jantung, ginjal, hati, sistem saraf, dan struktur vital lainnya.

Klasifikasi amyloidosis didasarkan pada komposisi biokimia protein fibrilar yang terlibat. Primary amyloidosis (tipe AL) dikaitkan dengan gangguan sel plasma dan merupakan bentuk yang paling umum, di mana immunoglobulin light chains (kappa atau lambda) membentuk deposit amyloid. Secondary amyloidosis (tipe AA) berkembang sebagai konsekuensi dari kondisi inflamasi kronis seperti tuberkulosis, rheumatoid arthritis, dan keadaan inflamasi persisten lainnya, dengan protein amyloid A sebagai komponen utama. Heredofamilial amyloidosis (tipe ATTR) hasil dari mutasi genetik pada transthyretin, protein transpor untuk thyroxine dan retinol-binding protein. Selain itu, bentuk terlokalisasi dari amyloidosis dapat terjadi pada organ yang terisolasi tanpa keterlibatan sistemik.

Teknik pewarnaan Congo Red, yang pertama kali diperkenalkan pada awal abad ke-20, tetap menjadi metode histopatologi definitif untuk identifikasi amyloid. Pendekatan yang telah teruji waktu ini tidak hanya memberikan visualisasi morfologi deposit amyloid tetapi juga menghasilkan birefringence hijau apel yang patognomonik di bawah mikroskopi polarized light, menjadikannya sebagai gold standard untuk diagnosis amyloid dalam praktik klinis.

Tujuan

Teknik pewarnaan Congo Red melayani beberapa tujuan kritis dalam praktik histopatologi modern. Tujuan utama adalah untuk mencapai identifikasi definitif deposit amyloid melalui demonstrasi karakteristik morfologi dan sifat optik yang membedakan amyloid dari akumulasi protein lain atau komponen jaringan. Identifikasi ini penting untuk diagnosis akurat varian amyloidosis, termasuk bentuk sistemik yang dapat mempengaruhi beberapa sistem organ dan deposit terlokalisasi yang tetap terbatas pada situs anatomis tertentu.

Selain identifikasi dasar, teknik ini memungkinkan penilaian semi-kuantitatif beban amyloid dalam jaringan, memberikan informasi berharga untuk staging keparahan penyakit dan memantau respons terapeutik. Pewarnaan Congo Red juga memfasilitasi diagnosis diferensial dengan mengecualikan kondisi lain yang mungkin menunjukkan manifestasi klinis serupa tetapi tidak memiliki deposit amyloid yang karakteristik.

Dalam aplikasi penelitian, metode pewarnaan ini mendukung investigasi mekanisme amyloidogenesis, evaluasi intervensi terapeutik novel, dan studi epidemiologi prevalensi amyloidosis. Sifat standar dari teknik Congo Red memastikan hasil yang dapat direproduksi di berbagai laboratorium dan institusi, menjadikannya sangat berharga untuk kolaborasi penelitian multi-center dan program jaminan kualitas dalam histopatologi diagnostik.

Prinsip

Mekanisme pewarnaan Congo Red didasarkan pada interaksi molekuler spesifik antara molekul pewarna Congo Red dan karakteristik struktural unik fibril amyloid. Protein amyloid memiliki struktur cross-β yang khas, di mana β-strands disusun tegak lurus terhadap sumbu fibril, menciptakan parallel β-pleated sheets yang berjalan sepanjang fibril. Struktur yang sangat teratur dan berulang ini menyediakan situs pengikatan spesifik untuk molekul Congo Red.

Pewarna Congo Red menginterkalasi antara parallel β-pleated sheets ini melalui pembentukan ikatan hidrogen non-polar dan gaya van der Waals. Interkalasi ini bukan hanya fenomena permukaan tetapi melibatkan penyisipan molekul Congo Red planar ke dalam ruang antara β-sheets, menciptakan kompleks pewarna-protein yang stabil. Susunan teratur molekul pewarna yang dihasilkan dalam struktur amyloid bertanggung jawab atas sifat optik karakteristik yang diamati di bawah pemeriksaan mikroskopis.

Di bawah mikroskopi bright-field konvensional, kompleks Congo Red-amyloid muncul sebagai deposit merah muda hingga merah yang dalam. Namun, ciri khas diagnostik ditumlah di bawah mikroskopi polarized light, di mana susunan teratur molekul pewarna menghasilkan birefringence hijau apel yang karakteristik. Birefringence ini dihasilkan dari sifat optik anisotropik molekul Congo Red yang sejajar dalam matriks amyloid, menciptakan fenomena yang spesifik dan patognomonik untuk deposit amyloid.

Spesifisitas interaksi ini luar biasa, karena Congo Red tidak mengikat secara signifikan pada struktur protein lain yang tidak memiliki arsitektur cross-β, termasuk protein asli, kolagen, atau protein fibrilar lain yang ditemukan dalam jaringan. Selektivitas ini membuat pewarnaan Congo Red sangat dapat diandalkan untuk identifikasi amyloid, meskipun hasil optimal memerlukan perhatian yang cermat pada kondisi pewarnaan dan persiapan reagen.

Persiapan Alat dan Bahan

Larutan dan Reagen yang Diperlukan

Larutan Sodium Hydroxide 1%:
- Sodium Hydroxide: 1 g
- Air suling: 100 ml

Saturated Sodium Chloride dalam Etanol 80%:
- Etanol 80%: 100 ml
- Sodium Chloride: 1 g

Larutan Alkaline Alcohol Sodium Chloride:
- Sodium Hydroxide 1%: 1 ml
- Sodium chloride ethanol (80%): 100 ml
- Catatan: Siapkan larutan segar segera sebelum digunakan

Larutan Stock Alkaline Congo Red:
- Congo red: 0,5 g
- Larutan alkaline alcohol sodium chloride: 300 ml

Larutan Kerja Congo Red:
- Larutan stock alkaline congo red: 100 ml
- Sodium Hydroxide 1%: 1 ml
- Catatan: Gunakan hanya larutan yang baru disiapkan

Persiapan Alternatif (Metode Highman)

Larutan Congo Red:
- Ethyl alcohol 50%: 100 ml
- Congo red: 0,5 g

Potassium Hydroxide (0,2%):
- Ethyl alcohol 80%: 100 ml
- Potassium hydroxide: 0,2 g

Prosedur

Metode Pewarnaan Alkaline Congo Red

1. Deparaffinize bagian jaringan secara lengkap
2. Bawa bagian melalui alkohol bertingkat ke air
3. Bilas dalam air suling: 10 hingga 15 celupan
4. Warnai dengan Mayer's Hematoxylin untuk pewarnaan inti
5. Biru inti dengan menjalankan air keran
6. Cuci bersih dalam air suling
7. Rawat dengan larutan alkaline alcohol sodium chloride: 20 menit
8. Aplikasikan larutan alkaline Congo red: 20 menit
9. Lakukan dehidrasi cepat melalui alkohol bertingkat
10. Jernihkan dalam xylene
11. Mount dengan medium mounting yang sesuai

Pewarnaan Congo Red dengan Metode Highman

1. Deparaffinize bagian secara lengkap
2. Bawa bagian melalui alkohol bertingkat ke air
3. Bilas dalam air suling: 10 hingga 15 celupan
4. Aplikasikan larutan Congo red: 5 menit
5. Diferensiasi menggunakan alcoholic Potassium hydroxide: hanya beberapa detik
6. Cuci bersih dalam air
7. Counterstain dengan Alum Haematoxylin
8. Biru dengan air keran mengalir
9. Cuci dengan air suling
10. Lakukan dehidrasi cepat
11. Jernihkan dalam xylene
12. Mount dengan tepat

Interpretasi Hasil

Pewarnaan Congo Red menghasilkan hasil yang khas dan diagnostik yang penting untuk identifikasi amyloid. Di bawah mikroskopi cahaya konvensional, deposit amyloid muncul sebagai struktur merah muda hingga merah yang dalam dengan morfologi yang terdefinisi dengan baik, kontras dengan jelas dengan elemen jaringan sekitarnya. Namun, fitur patognomonik yang secara definitif mengkonfirmasi keberadaan amyloid adalah birefringence hijau apel yang karakteristik yang diamati di bawah pemeriksaan polarized light.

Birefringence hijau ini unik untuk deposit amyloid dan mewakili susunan teratur molekul Congo Red dalam struktur β-pleated sheet fibril amyloid. Intensitas dan keseragaman birefringence ini dapat memberikan informasi tambahan tentang kepadatan dan organisasi deposit amyloid. Interpretasi yang tepat memerlukan pemeriksaan sistematis di bawah cahaya konvensional dan terpolarisasi, karena beberapa deposit protein mungkin menunjukkan positivitas Congo Red yang lemah tanpa birefringence yang karakteristik, menunjukkan akumulasi protein non-amyloid.

Keuntungan dan Kerugian

Keuntungan

Teknik pewarnaan Congo Red menawarkan banyak keuntungan yang menarik yang telah menetapkan dan mempertahankan posisinya sebagai gold standard untuk deteksi amyloid dalam histopatologi klinis. Spesifisitas metode yang luar biasa untuk deposit amyloid, yang ditunjukkan melalui validasi klinis selama beberapa dekade, memberikan kepercayaan diagnostik yang sedikit teknik histokimia lain dapat menandingi. Birefringence hijau apel patognomonik di bawah polarized light berfungsi sebagai penanda diagnostik yang tidak ambigu yang menghilangkan banyak interpretasi subjektif yang terkait dengan metode pewarnaan lain.

Dari sudut pandang praktis, teknik ini menunjukkan efektivitas biaya dan aksesibilitas yang sangat baik, hanya memerlukan peralatan laboratorium standar dan reagen yang mudah tersedia. Metode ini bekerja dengan andal pada bagian jaringan yang diproses secara rutin, difiksasi formalin, dan ditanam parafin, terintegrasi dengan mulus ke dalam workflow histopatologi standar tanpa memerlukan persiapan atau protokol pemrosesan jaringan khusus.

Permanensi hasil pewarnaan Congo Red memungkinkan penyimpanan arsip jangka panjang dan tinjauan retrospektif, mendukung program jaminan kualitas dan kegiatan pendidikan. Selain itu, teknik ini memberikan informasi morfologi yang berharga tentang pola distribusi amyloid, kepadatan, dan hubungan dengan struktur jaringan sekitarnya, informasi yang dapat mempengaruhi keputusan manajemen klinis dan penilaian prognosis.

Kerugian

Meskipun penerimaan yang luas dan utilitas klinis, teknik pewarnaan Congo Red memiliki beberapa keterbatasan penting yang harus diakui dan dikelola dalam praktik rutin. Sensitivitas metode dapat tidak mencukupi untuk mendeteksi deposit amyloid awal atau minimal, berpotensi menyebabkan hasil false-negative dalam kasus dengan beban penyakit terbatas atau pola deposisi fokal.

Tantangan teknis termasuk pentingnya kritis kesegaran reagen dan persiapan yang tepat, karena larutan yang sudah tua atau tidak disiapkan dengan benar dapat menghasilkan pola pewarnaan yang lemah atau tidak konsisten. Kondisi alkali yang diperlukan untuk pengikatan Congo Red optimal dapat menyebabkan artefak morfologi jaringan pada beberapa spesimen, berpotensi mengganggu evaluasi histologi bersamaan.

Interpretasi birefringence polarized light memerlukan keahlian dan pengalaman yang cukup, karena artefak dari pemrosesan jaringan, media mounting, atau peralatan optik dapat menciptakan penampilan yang membingungkan yang dapat disalahartikan oleh pengamat yang tidak berpengalaman. Selain itu, beberapa protein fibrilar non-amyloid mungkin kadang-kadang menunjukkan positivitas Congo Red yang lemah tanpa birefringence yang karakteristik, memerlukan korelasi yang hati-hati dengan temuan klinis dan laboratorium lainnya.

Teknik ini juga tidak memiliki kemampuan untuk membedakan antara berbagai jenis protein amyloid, memerlukan analisis imunohistokimia atau biokimia tambahan untuk karakterisasi amyloid lengkap dalam banyak skenario klinis.

Catatan

Pertimbangan Teknis dan Quality Control

Keberhasilan pewarnaan Congo Red sangat bergantung pada beberapa faktor teknis yang memerlukan perhatian dan standardisasi yang cermat. Persiapan reagen merupakan aspek yang paling krusial, dengan penekanan khusus pada penggunaan hanya larutan kerja yang baru disiapkan, karena larutan Congo Red yang sudah tua kehilangan afinitas pengikatan dan menghasilkan hasil yang tidak optimal. pH larutan alkali harus dipantau dan dipertahankan dengan hati-hati dalam rentang yang ditentukan (biasanya pH 11-12) untuk memastikan interaksi pewarna-protein yang optimal.

Kontrol suhu selama prosedur pewarnaan dapat secara signifikan mempengaruhi hasil, dengan inkubasi suhu ruangan umumnya memberikan hasil yang paling konsisten. Presisi waktu penting, karena under-staining dan over-staining dapat mengganggu akurasi diagnostik. Langkah diferensiasi, ketika termasuk dalam protokol, memerlukan keterampilan dan pengalaman khusus untuk mencapai kontras optimal antara deposit amyloid dan jaringan latar belakang.

Quality Assurance dan Kontrol

Tindakan quality control yang komprehensif sangat penting untuk mempertahankan keandalan dan akurasi hasil pewarnaan Congo Red. Bagian kontrol positif yang diketahui mengandung deposit amyloid yang dikonfirmasi harus dimasukkan dengan setiap staining run untuk memverifikasi fungsi reagen dan kecukupan pewarnaan. Kontrol ini idealnya harus mewakili berbagai jenis amyloid untuk memastikan validasi spektrum luas.

Bagian kontrol negatif dari jaringan yang diketahui bebas dari deposit amyloid membantu mengidentifikasi artefak potensial, pewarnaan non-spesifik, atau kontaminasi reagen. Selain itu, bagian yang tidak diwarnai harus diperiksa di bawah polarized light untuk mendeteksi bahan birefringent intrinsik yang mungkin mengganggu interpretasi.

Teknik Komplementer

Meskipun pewarnaan Congo Red tetap menjadi gold standard untuk deteksi amyloid, itu harus dianggap sebagai bagian dari pendekatan diagnostik yang komprehensif. Pewarnaan Thioflavin T dapat berfungsi sebagai metode screening yang sensitif, meskipun tidak memiliki spesifisitas Congo Red. Teknik imunohistokimia menggunakan antibodi spesifik terhadap protein amyloid yang berbeda (seperti AA, AL kappa, AL lambda, atau ATTR) dapat memberikan informasi penting tentang jenis amyloid dan memandu manajemen klinis yang tepat.

Dalam kasus yang menantang atau ketika hasil Congo Red meragukan, electron microscopy dapat memberikan konfirmasi ultrastruktural fibril amyloid, biasanya muncul sebagai fibril yang tidak bercabang dengan diameter 8-12 nm. Analisis proteomik berbasis mass spectrometry mewakili metode yang paling definitif untuk identifikasi protein amyloid dan semakin digunakan di pusat-pusat khusus untuk typing amyloid yang tepat.

Penyimpanan dan Preservasi

Kondisi penyimpanan yang tepat untuk bagian yang diwarnai Congo Red penting untuk mempertahankan kualitas diagnostik dari waktu ke waktu. Bagian harus disimpan dalam kondisi gelap untuk mencegah fotodegradasi pewarna Congo Red, yang dapat menyebabkan pudar dan kehilangan kejelasan diagnostik. Pemilihan media mounting yang tepat juga dapat mempengaruhi preservasi jangka panjang kualitas pewarnaan.

Dokumentasi digital dari gambar bright-field dan polarized light disarankan untuk penyimpanan catatan permanen dan tujuan konsultasi, terutama untuk kasus yang mungkin memerlukan evaluasi tindak lanjut atau berfungsi sebagai materi referensi untuk kegiatan pendidikan.

Referensi

1. Suvarna, S.K., Layton, C., & Bancroft, J.D. (2018). Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques (8th ed.). Elsevier.
2. Dey, P. (2022). Amyloid Staining. In: Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology (pp. 114-115). Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-19-6616-3_11
3. Highman, B. (1946). Improved methods for demonstrating amyloid in paraffin sections. Archives of Pathology, 41, 559–562.