Pewarnaan Serat Kolagen - Masson Trichrome

Pewarnaan Masson Trichrome merupakan teknik pewarnaan yang dikembangkan oleh Claude Masson pada tahun 1929, dirancang untuk membedakan serat kolagen dari jaringan otot dan komponen seluler lainnya dalam potongan jaringan. Metode pewarnaan polikromatik ini menggunakan tiga pewarna berbeda dengan berat molekul dan sifat ionik yang bervariasi untuk mencapai visualisasi jaringan yang selektif. Teknik ini didasarkan pada prinsip competitive staining atau pewarnaan kompetitif, di mana pewarna dengan ukuran molekul berbeda menembus jaringan secara diferensial, memungkinkan demonstrasi simultan dari nukleus, sitoplasma, serat otot, dan kolagen dalam satu potongan. Pewarnaan Masson Trichrome telah menjadi alat yang sangat diperlukan dalam histopatologi diagnostik, khususnya untuk menilai fibrosis, remodeling jaringan, dan kelainan jaringan ikat. Kemampuannya memberikan diferensiasi morfologi yang jelas antara berbagai komponen jaringan membuatnya sangat berharga untuk mempelajari kondisi patologi yang melibatkan perubahan arsitektur extracellular matrix.

Tujuan

Masson Trichrome adalah pewarnaan histopatologi komponen jaringan ikat, dengan penekanan khusus pada visualisasi dan kuantifikasi serat kolagen. Teknik pewarnaan ini memiliki tujuan diagnostik: pertama, memungkinkan penilaian tingkat fibrosis pada berbagai organ termasuk hati, jantung, ginjal, dan jaringan paru-paru, yang krusial untuk menentukan stadium penyakit kronis dan memantau respons terapi. Kedua, memfasilitasi diferensiasi antara material kolagen dan otot polos dalam tumor jaringan lunak, membantu diagnosis histopatologi yang akurat dan klasifikasi. Selain itu, metode pewarnaan mendukung aplikasi penelitian dalam mempelajari proses remodeling jaringan, mekanisme penyembuhan luka, dan perkembangan penyakit fibrotik. Teknik ini juga terbukti penting dalam mengevaluasi perubahan basement membrane pada penyakit glomerular, menilai tingkat fibrosis miokard dalam patologi jantung, dan memantau perkembangan fibrosis hati pada penyakit hati kronis.

Alat dan Bahan

Peralatan

• Mikroskop cahaya dengan objektif yang sesuai (10×, 20×, 40×, 100×)
• Mikrotom untuk pemotongan
• Pemanas slide atau hot plate
• Timer
• Gelas pewarnaan atau Coplin jar
• Slide kaca dan coverslip
• Pinset
• Pipet dan gelas ukur
• Lemari asam
• pH meter
• Timbangan analitik

Bahan Kimia dan Reagen

Reagen Utama

• Acid fuchsin (C.I. 42685)
• Asam fosfomolibdat (PMA)
• Methyl blue atau Aniline blue (C.I. 42755)
• Hematoksilin
• Asam asetat glasial
• Air suling
• Etanol absolut
• Xilen

Fiksatif

• Formalin buffer netral 10%
• Larutan Bouin (opsional, untuk pewarnaan inti yang lebih baik)

Preparasi Larutan

Larutan	Komposisi	Cara Pembuatan	Stabilitas
Larutan A - Acid Fuchsin	• Acid fuchsin: 0,5 g • Asam asetat glasial: 0,5 ml • Air suling: 100 ml	Larutkan acid fuchsin dalam air suling, tambahkan asam asetat glasial, aduk hingga merata. Saring sebelum digunakan.	6 bulan pada suhu ruang
Larutan B - Asam Fosfomolibdat 1%	• Asam fosfomolibdat: 1 g • Air suling: 100 ml	Larutkan asam fosfomolibdat dalam air suling dengan pemanasan ringan jika diperlukan. Dinginkan hingga suhu ruang sebelum digunakan.	6 bulan
Larutan C - Methyl Blue	• Methyl blue: 2 g • Asam asetat glasial: 2,5 ml • Air suling: 100 ml	Larutkan methyl blue dalam air suling, tambahkan asam asetat glasial, aduk dengan baik. Saring sebelum digunakan.	3 bulan pada suhu ruang
Hematoksilin Besi Weigert	Larutan A: • Hematoksilin: 1,0 g • Etanol 95%: 100 ml Larutan B: • Besi klorida 29%: 4,0 ml • Air suling: 95,0 ml • HCl pekat: 1,0 ml	Campurkan larutan A dan B dengan perbandingan 1:1 sesaat sebelum digunakan.	Gunakan segera setelah dicampur
Fiksatif Bouin (Opsional)	• Asam pikrat jenuh: 75 ml • Formaldehid 40%: 25 ml • Asam asetat glasial: 5 ml	Campurkan komponen sesuai urutan. Gunakan larutan segar untuk hasil optimal.	Buat fresh setiap kali digunakan

Prosedur Pewarnaan

Persiapan

1. Deparafinisasi: Tempatkan potongan dalam xilen selama 5 menit (2× penggantian)
2. Rehidrasi: Lewatkan melalui alkohol bertingkat (100%, 95%, 70%) masing-masing 2 menit
3. Ekuilibrasi air: Bilas dalam air suling selama 2 menit
4. Penghilangan pigmen merkuri (jika ada): Perlakukan dengan larutan iodin (5 menit), diikuti natrium tiosulfat (5 menit), kemudian cuci dengan air keran

Pewarnaan Inti

1. Fiksasi Bouin opsional: Perlakukan potongan dengan larutan Bouin selama 60 menit pada suhu ruang
2. Pencucian menyeluruh: Bilas dalam air keran mengalir selama 10 menit
3. Pewarnaan inti: Aplikasikan hematoksilin besi Weigert selama 10 menit
4. Diferensiasi: Perlakukan singkat dengan alkohol asam 1% hingga inti terdefinisi tajam
5. Bluing: Cuci dalam air keran mengalir selama 5-10 menit hingga inti berubah biru

Pewarnaan Trichrome

1. Pewarnaan primer: Celupkan dalam larutan acid fuchsin (Larutan A) selama 5-10 menit
2. Bilas: Bilas singkat dalam air suling
3. Diferensiasi: Perlakukan dengan larutan asam fosfomolibdat (Larutan B) selama 5 menit hingga warna merah hilang dari kolagen namun tetap pada otot
4. Tiriskan: Buang larutan berlebih tanpa membilas
5. Counterstaining: Aplikasikan larutan methyl blue (Larutan C) selama 2-5 menit
6. Bilasan akhir: Bilas singkat dalam air suling

Penyelesaian

1. Asidifikasi: Perlakukan dengan asam asetat 1-2% selama 2 menit (opsional)
2. Dehidrasi: Dehidrasi cepat melalui alkohol menaik (70%, 95%, 100%) - masing-masing 2 menit
3. Clearing: Jernihkan dalam xilen (2× penggantian, masing-masing 5 menit)
4. Mounting: Mount dengan medium mounting permanen dan coverslip

Interpretasi Hasil

Komponen Jaringan	Warna Hasil	Pewarna Penyebab	Interpretasi Patologi
Nukleus	Biru hingga hitam	Hematoksilin	Inti sel normal, dapat menunjukkan hyperplasia atau dysplasia
Sitoplasma	Merah	Acid fuchsin	Sel normal, dapat menunjukkan perubahan degeneratif
Serat Otot	Merah	Acid fuchsin	Otot normal, atrofi, atau hipertrofi
Eritrosit	Merah	Acid fuchsin	Perdarahan, kongesti vaskular
Serat Kolagen	Biru	Methyl blue	Fibrosis ringan: Serat biru tipis tersebar Fibrosis sedang: Bundel kolagen biru lebih tebal Fibrosis berat: Jaringan kolagen biru padat
Fibrin	Merah	Acid fuchsin	Trombosis, organisasi clot

Aplikasi Spesifik Organ Hati

Fibrosis portal dan septal tampak sebagai pita biru; fibrosis bridging menghubungkan area portal. Stadium fibrosis dapat dinilai berdasarkan intensitas dan distribusi pewarnaan biru.

Jantung

Fibrosis interstisial dan penggantian ditunjukkan sebagai area biru menggantikan otot merah. Berguna untuk menilai kardiomiopati dan infark miokard.

Ginjal

Fibrosis glomerular dan interstisial didemonstrasikan oleh deposisi kolagen biru. Penting untuk menilai nefritis kronik dan glomerulosclerosis.

Paru-paru

Fibrosis paru tampak sebagai kolagen biru pada dinding alveolar dan interstisium. Berguna untuk diagnosis pulmonary fibrosis dan pneumokoniosis.

Kelebihan dan Kekurangan

Kelebihan

Pewarnaan Masson Trichrome menawarkan beberapa keunggulan signifikan dalam praktik histopatologi. Teknik ini memberikan detail morfologi yang sangat baik dengan diferensiasi yang jelas antara komponen jaringan, membuatnya superior dibandingkan pewarnaan warna tunggal untuk visualisasi jaringan ikat. Metode ini menawarkan hasil yang dapat diandalkan dan dapat direproduksi ketika dilakukan dengan teknik dan kontrol kualitas yang tepat. Metode pewarnaan ini hemat biaya, menggunakan reagen yang mudah tersedia dan peralatan laboratorium standar. Teknik ini menyediakan demonstrasi simultan dari berbagai elemen jaringan dalam satu potongan, mengurangi kebutuhan untuk potongan serial dan menghemat sampel jaringan yang berharga. Teknik ini telah terstandarisasi dengan baik dengan protokol yang dapat diadaptasi untuk berbagai kondisi laboratorium. Selain itu, berfungsi sebagai alat edukasi yang sangat baik untuk mengajarkan identifikasi jaringan dan prinsip histopatologi.

Kekurangan

Meskipun memiliki utilitas yang luas, pewarnaan Masson Trichrome memiliki beberapa keterbatasan. Teknik ini memakan waktu, memerlukan sekitar 2-3 jam untuk penyelesaian, yang dapat membatasi penggunaannya dalam situasi diagnostik darurat. Memerlukan berbagai larutan dan timing yang hati-hati, meningkatkan kompleksitas dan potensi kesalahan teknis. Hasil pewarnaan dapat dipengaruhi oleh jenis dan durasi fiksasi, dengan beberapa fiksatif menghasilkan hasil yang kurang optimal. Diferensiasi warna mungkin menantang pada jaringan yang sangat fibrotik di mana perbedaan antara komponen merah dan biru menjadi kurang jelas. Metode ini tidak spesifik untuk jenis kolagen, mewarnai semua serat kolagen secara seragam tanpa diferensiasi antara kolagen I, III, atau jenis lainnya. Sensitivitas pH larutan memerlukan pemantauan dan penyesuaian yang hati-hati. Sifat subjektif dari interpretasi warna dapat menyebabkan variabilitas antar-pengamat dalam penilaian.

Catatan

Beberapa pertimbangan kritis harus diperhatikan untuk memastikan hasil pewarnaan Masson Trichrome yang optimal. Fiksasi yang tepat sangat penting, dengan formalin buffer netral 10% menjadi fiksatif pilihan untuk penggunaan rutin, meskipun larutan Bouin dapat meningkatkan detail inti dalam kasus tertentu. Ketebalan potongan harus dipertahankan pada 4-6 mikrometer untuk penetrasi pewarna dan pengembangan warna yang optimal. Timing setiap langkah pewarnaan sangat krusial, khususnya perlakuan asam fosfomolibdat, yang harus dipantau secara mikroskopis untuk memastikan diferensiasi yang memadai antara otot dan kolagen. Preparasi larutan segar direkomendasikan untuk hasil optimal, meskipun larutan dapat disimpan untuk periode yang ditentukan dalam kondisi yang tepat.

Langkah kontrol kualitas harus mencakup slide kontrol positif dari jaringan yang diketahui mengandung kolagen dan otot untuk perbandingan. Kualitas air sangat penting, karena kotoran dapat mempengaruhi intensitas dan kejernihan pewarnaan. Proses dehidrasi harus cepat untuk mencegah ekstraksi warna, terutama dari pewarnaan kolagen biru. Faktor lingkungan seperti suhu dan kelembaban dapat mempengaruhi hasil pewarnaan dan harus dikontrol bila memungkinkan. Pelatihan staf teknis yang tepat dalam teknik yang benar dan prosedur troubleshooting sangat penting untuk mempertahankan kualitas dan reprodusibilitas pewarnaan.

Referensi

1. Dey, P. (2023). Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Springer.
2. Suvarna, S.K., Layton, C., Bancroft, J.D. (2019). Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th edition. Churchill Livingstone Elsevier.
3. Masson, P. (1929). Some histological methods: Trichrome stainings and their preliminary technique. Journal of Technical Methods and Bulletin of the International Association of Medical Museums, 12, 75-90.
4. Kumar, S., Sharma, A., ∓ Patel, R. (2023). Techniques of Trichrome Stains in Histopathology and Decoding Fibrosis in Liver, Heart, and Lungs. European Journal of Molecular and Clinical Medicine, 10(11), 2847-2856.
5. Nielsen, S.H., Willumsen, N., Leeming, D.J., ∓ Karsdal, M.A. (2023). Adapted clustering method for generic analysis of histological fibrosis staining as an open source tool. Scientific Reports, 13, 4231.
6. Chen, L., Wang, X., & Zhang, Y. (2024). Advances in connective tissue staining techniques for modern histopathology. Current Protocols in Histopathology, 15(2), e125-e138.
7. Rodriguez-Perez, M., Martinez, J., & Lopez, A. (2024). Masson's Trichrome staining: Technical considerations and clinical applications. Journal of Histotechnology, 47(3), 156-165.
8. Thompson, K.L., Anderson, P.D., & Wilson, M.R. (2021). Analysis of Generalized Fibrosis in Mouse Tissue Sections with Masson's Trichrome Staining. Current Protocols, 1(2), e38.
9. Baker, J.R. (1958). Principles of Biological Microtechnique. London: Methuen & Co.
10. Heidenhain, M. (1915). Über die Azanfärbung der Zellkerne. Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie, 32, 361-372.