Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) pada Bakteri - Triple Sugar Iron Agar Test

Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA) telah menjadi salah satu metode penting dalam mikrobiologi klinis untuk mengidentifikasi bakteri enterik sejak awal abad ke-20. Perjalanan dimulai pada tahun 1911 ketika Russell mengembangkan media yang mengandung dua gula untuk membedakan basil gram-negatif intestinal. Menyadari bahwa produksi hidrogen sulfida merupakan karakteristik diagnostik yang berharga, peneliti selanjutnya menambahkan garam timbal atau besi ke dalam media. Kliger menyempurnakan pendekatan ini dengan menambahkan timbal asetat dan garam besi untuk mendeteksi produksi H₂S serta menggunakan fenol merah sebagai indikator pH, menciptakan apa yang kemudian dikenal sebagai Kligler's Iron Agar (KIA).

Perkembangan berlanjut pada tahun 1917 ketika Krunweide dan Kohn memodifikasi media Russell dengan menambahkan sukrosa sebagai gula ketiga. Penambahan ini terbukti penting karena memungkinkan deteksi lebih awal bakteri koliform yang memfermentasi sukrosa lebih cepat daripada laktosa, serta membantu mengidentifikasi bakteri gram-negatif tertentu yang mampu memfermentasi sukrosa tetapi tidak dapat memfermentasi laktosa. Pada tahun 1940, Difco Laboratories bersama Sulkin dan Willet, serta Hajna, mengembangkan formulasi TSIA modern yang kita gunakan saat ini. Media yang ada sekarang pada dasarnya mengikuti formula Sulkin dan Willet, dengan fenol merah menggantikan brom timol biru sebagai indikator pH, kombinasi pepton menggantikan tripton, dan penambahan ekstrak ragi.

TSIA tetap banyak digunakan di laboratorium klinis dan penelitian, khususnya untuk skrining patogen fekal dan membedakan anggota famili Enterobacteriaceae. Media ini juga bermanfaat untuk mengidentifikasi bakteri gram-negatif lainnya dan beberapa organisme gram-positif berdasarkan pola fermentasi karbohidrat dan kemampuan produksi hidrogen sulfida.

Tujuan

Uji Triple Sugar Iron Agar memiliki beberapa tujuan diagnostik dalam analisis mikrobiologi. Tujuan utamanya adalah membedakan bakteri berdasarkan kemampuannya memfermentasi tiga karbohidrat spesifik: glukosa (0,1%), laktosa (1%), dan sukrosa (1%). Uji ini dapat membedakan antara organisme yang hanya memfermentasi glukosa, organisme yang memfermentasi glukosa ditambah laktosa dan/atau sukrosa, serta organisme yang tidak dapat memfermentasi ketiga gula tersebut. Selain itu, TSIA mendeteksi produksi hidrogen sulfida (H₂S) yang sangat penting untuk mengidentifikasi bakteri patogen tertentu seperti spesies Salmonella dan membedakannya dari organisme serupa. Media ini juga mengungkapkan produksi gas dari fermentasi karbohidrat, memberikan diferensiasi lebih lanjut di antara spesies bakteri. TSIA sangat berharga sebagai alat skrining untuk patogen enterik dalam spesimen klinis, membantu mempersempit identifikasi potensial dengan cepat sebelum dilakukan uji konfirmasi yang lebih spesifik. Untuk organisme yang sulit tumbuh dan mungkin tidak bereaksi di media lain, TSIA menyediakan metode alternatif untuk menentukan kemampuan fermentasi glukosa, menjadikannya alat yang serbaguna dalam laboratorium mikrobiologi.

Prinsip

Uji TSIA beroperasi berdasarkan beberapa prinsip biokimia yang saling terkait. Media mengandung tiga karbohidrat dalam konsentrasi berbeda: glukosa 0,1%, sedangkan laktosa dan sukrosa masing-masing 1%. Perbedaan konsentrasi 10 kali lipat ini sangat penting untuk interpretasi hasil. Media disiapkan sebagai agar miring, menciptakan dua lingkungan berbeda: permukaan miring yang aerobik dan dasar (butt) yang anaerobik. Fenol merah berfungsi sebagai indikator pH, tampak merah-oranye pada pH netral, berubah kuning dalam kondisi asam (pH di bawah 6,8), dan menjadi merah tua dalam kondisi alkali.

Ketika bakteri memfermentasi karbohidrat, mereka menghasilkan produk akhir asam yang menurunkan pH, menyebabkan media berubah kuning. Interpretasi bergantung pada gula mana yang difermentasi dan ketersediaan oksigen. Bakteri yang hanya memfermentasi glukosa awalnya menghasilkan asam di seluruh tabung dalam beberapa jam. Namun, karena glukosa ada dalam konsentrasi rendah (0,1%), glukosa cepat habis. Di bagian miring yang aerobik, bakteri kemudian beralih ke metabolisme oksidatif pepton, yang melepaskan amonia dan meningkatkan pH, mengubah bagian miring menjadi merah (alkali). Di bagian dasar yang anaerobik, di mana metabolisme oksidatif tidak dapat terjadi, asam dari fermentasi glukosa tetap ada, menjaga dasar tetap kuning. Ini menghasilkan reaksi khas alkali/asam (K/A).

Bakteri yang memfermentasi laktosa dan/atau sukrosa (ada pada konsentrasi 1% masing-masing) terus menghasilkan asam dalam jumlah besar bahkan setelah glukosa habis, mempertahankan keasaman baik di bagian miring maupun dasar, menghasilkan reaksi asam/asam (A/A). Organisme yang tidak dapat memfermentasi gula apa pun menggunakan pepton sebagai sumber energi mereka. Jika mereka dapat memetabolisme pepton baik secara aerobik maupun anaerobik, bagian miring dan dasar berubah merah (K/K). Jika pepton hanya dimetabolisme secara aerobik, bagian miring berubah merah sedangkan dasar tidak berubah (K/NC).

Produksi gas dari fermentasi karbohidrat muncul sebagai gelembung, retakan, atau perpindahan media. Produksi hidrogen sulfida terjadi ketika bakteri mereduksi natrium tiosulfat dalam media menjadi gas H₂S. Gas H₂S yang tidak berwarna bereaksi dengan ion besi (dari besi sulfat atau besi amonium sitrat) membentuk besi sulfida, endapan hitam yang tidak larut. Yang penting, produksi H₂S memerlukan lingkungan asam, jadi meskipun endapan hitam menutupi warna kuning, dasar tetap asam jika H₂S diproduksi.

Alat dan Bahan

Media:

• Agar miring Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dalam tabung (disiapkan secara komersial atau dari bubuk dehidrasi)
• Tabung harus memiliki dasar yang dalam dengan bagian miring dan dasar yang kira-kira sama panjangnya

Resep TSIA (jika membuat dari awal):

Bahan	Jumlah
Pepton kasein pankreas (atau ekstrak daging sapi 3,0 g + ekstrak ragi 3,0 g + pepton 20,0 g)	10,0 g
Pepton jaringan hewan peptik	10,0 g
Glukosa	1,0 g
Laktosa	10,0 g
Sukrosa	10,0 g
Besi sulfat atau besi amonium sulfat	0,2 g
Natrium klorida (NaCl)	5,0 g
Natrium tiosulfat	0,3 g
Fenol merah	0,024 g
Agar	13,0 g
Air suling	1.000 mL

Peralatan dan Perlengkapan:

• Jarum inokulasi steril lurus (kawat atau sekali pakai)
• Inkubator 35-37°C (aerobik, tanpa peningkatan CO₂)
• Tabung tutup sekrup 16 x 125 mm
• Autoklaf
• Opsional: Strip kertas timbal asetat (untuk mendeteksi kadar H₂S rendah)

Organisme Kontrol Kualitas:

Organisme	Nomor ATCC
Escherichia coli	25922
Salmonella enterica serovar Typhimurium	14028
Pseudomonas aeruginosa	27853
Campylobacter hyointestinalis (Opsional)	35217

Prosedur

Persiapan Media (jika membuat dari awal):

• Campurkan semua bahan dalam air suling dan sesuaikan pH menjadi 7,3
• Panaskan sambil diaduk hingga agar larut sempurna
• Distribusikan 5-7 ml alikuot ke dalam tabung tutup sekrup 16 x 125 mm
• Autoklaf pada 121°C selama 15 menit (jangan terlalu panas)
• Dinginkan tabung dalam posisi miring untuk membuat dasar 2,5 cm dan miring 3,8 cm
• Simpan pada 2-4°C (beberapa lebih suka 25°C untuk mencegah pembentukan retakan)

Kontrol Kualitas:

• Periksa setiap tabung sebelum digunakan untuk retakan, dehidrasi, kontaminasi, gelembung, atau kerusakan beku
• Buang tabung dengan gelembung dalam agar atau yang tidak berwarna merah
• Pastikan bagian miring dan dasar kira-kira sama panjang
• Uji setiap lot baru dengan organisme kontrol sebelum digunakan untuk pasien

Prosedur Inokulasi:

1. Hangatkan media hingga suhu ruang dan periksa retakan
2. Menggunakan jarum inokulasi lurus steril, sentuh bagian tengah koloni yang terisolasi dengan baik
3. Tusukkan jarum lurus ke bawah ke dalam dasar hingga dalam 3-5 mm dari bagian bawah
4. Tarik jarum sepanjang garis tusukan yang sama
5. Goreskan seluruh permukaan miring dengan pola zigzag
6. Opsional untuk organisme yang sulit tumbuh: Masukkan strip kertas timbal asetat di bagian atas tabung dan amankan dengan tutup
7. Letakkan tutup secara longgar pada tabung (jangan dikencangkan untuk memungkinkan akses udara)
8. Inkubasi secara aerobik pada 35-37°C selama 18-24 jam

Pembacaan Hasil:

• Periksa tabung pada 18-24 jam (pembacaan sebelum 18 jam dapat memberikan hasil palsu)
• Amati warna bagian miring dan dasar
• Periksa produksi gas (gelembung, retakan, atau media yang berpindah)
• Cari endapan hitam yang menunjukkan produksi H₂S
• Catat hasil segera atau simpan tabung di lemari es jika pembacaan akan ditunda
• Jangan menginterpretasikan reaksi fermentasi gula setelah 24 jam
• Jika diperlukan, perpanjang inkubasi hanya untuk mendeteksi produksi H₂S (Campylobacter mungkin memerlukan 3 hari untuk H₂S)

Interpretasi

Pengamatan Warna:

1. Warna kuning = Produksi asam (pH < 6,8)
2. Warna merah = Reaksi alkali (pH > 7,4)
3. Oranye/tidak berubah = Netral (tidak ada perubahan dari warna asli)

Pola Fermentasi Karbohidrat:

Reaksi	Tampilan	Interpretasi	Contoh Organisme
K/A	Miring merah / Dasar kuning	Hanya glukosa difermentasi Laktosa dan sukrosa TIDAK difermentasi Non-laktosa fermenter	Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Morganella morganii, Shigella spp., Salmonella spp., Proteus spp.
A/A	Miring kuning / Dasar kuning	Glukosa DAN laktosa dan/atau sukrosa difermentasi	Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae
K/K	Miring merah / Dasar merah	Tidak ada karbohidrat difermentasi Pepton dimetabolisme aerobik dan anaerobik	Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp.
K/NC	Miring merah / Dasar tidak berubah	Tidak ada karbohidrat difermentasi Pepton hanya dimetabolisme aerobik	Reaksi yang kurang umum

Produksi Gas:

1. Positif: Gelembung, retakan dalam agar, atau media terdorong ke atas tabung
2. Negatif: Tidak ada gangguan pada media
3. Penghasil gas umum: E. coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp. (bervariasi)

Produksi Hidrogen Sulfida (H₂S):

1. Positif: Warna hitam di seluruh media, cincin hitam pada pertemuan dasar dan miring, atau endapan hitam di dasar
2. H₂S tingkat rendah: Tidak ada penghitaman agar tetapi penghitaman kertas timbal asetat (jika digunakan)
3. Catatan: H₂S berat dapat menutupi warna kuning dasar, tetapi produksi asam tetap harus dicatat
4. Penghasil H₂S umum: Salmonella spp., Proteus spp., Citrobacter freundii, Edwardsiella tarda

Contoh Hasil

Organisme	Reaksi TSIA	Gas	H₂S	Interpretasi
Escherichia coli	A/A	+	−	Glukosa, laktosa/sukrosa fermenter dengan gas
Salmonella Typhimurium	K/A	±	+	Glukosa fermenter, penghasil H₂S
Shigella spp.	K/A	−	−	Hanya glukosa fermenter
Klebsiella pneumoniae	A/A	+	−	Glukosa, laktosa/sukrosa fermenter dengan gas
Proteus mirabilis	K/A	±	+	Glukosa fermenter, penghasil H₂S
Pseudomonas aeruginosa	K/K	−	−	Non-fermenter
Citrobacter freundii	K/A atau A/A	±	+	Laktosa fermenter bervariasi, penghasil H₂S
Enterobacter aerogenes	A/A	+	−	Glukosa, laktosa/sukrosa fermenter dengan gas
Edwardsiella tarda	K/A	+	+	Glukosa fermenter, penghasil gas dan H₂S

Kelebihan dan Kekurangan

Kelebihan:

Uji TSIA menawarkan beberapa manfaat praktis dalam mikrobiologi klinis. Ini merupakan alat skrining yang sederhana dan hemat biaya yang memberikan berbagai informasi dari satu inokulasi, termasuk fermentasi glukosa, fermentasi laktosa/sukrosa, produksi gas, dan produksi H₂S. Media tersedia secara komersial dan stabil dengan umur simpan yang wajar jika disimpan dengan benar. TSIA sangat berharga untuk skrining kultur fekal guna mengidentifikasi patogen potensial dan dapat membedakan organisme yang sulit tumbuh yang mungkin tidak bereaksi di media fermentasi lainnya. Uji ini telah terstandarisasi dengan baik dengan prosedur kontrol kualitas dan kriteria interpretasi yang mapan. Hasil biasanya tersedia dalam 18-24 jam, menjadikannya berguna untuk identifikasi awal yang cepat. Sifat visual dari hasil (perubahan warna dan gelembung gas) membuatnya mudah dibaca dan diinterpretasi, bahkan oleh personel laboratorium yang kurang berpengalaman.

Kekurangan:

Meskipun bermanfaat, TSIA memiliki beberapa keterbatasan yang harus dipertimbangkan. Media tidak dapat membedakan antara fermentasi laktosa dan sukrosa karena keduanya menghasilkan reaksi A/A yang sama. Produksi H₂S berat dapat menutupi reaksi asam yang mendasari di dasar, meskipun fermentasi glukosa masih harus disimpulkan jika H₂S ada. Ketika digunakan untuk skrining kultur fekal, KIA (yang tidak memiliki sukrosa) tidak dapat memisahkan beberapa non-laktosa fermenter yang tidak umum seperti Providencia spp. yang memfermentasi sukrosa dari patogen sejati. Sebaliknya, TSIA dapat memberikan reaksi A/A dengan Yersinia enterocolitica dan Edwardsiella tarda (keduanya sukrosa-positif tetapi laktosa-negatif), yang berpotensi menyebabkan kebingungan dalam skrining kultur fekal.

Baik TSIA maupun KIA, tanpa uji tambahan seperti uji PYR, tidak dapat membedakan Salmonella laktosa-positif (strain lisogenik) dari spesies Citrobacter. Produksi gas umumnya lebih baik terdeteksi di TSIA daripada KIA, tetapi produksi H₂S dapat terhambat di TSIA untuk organisme yang menggunakan sukrosa, karena ini menekan mekanisme enzim yang diperlukan untuk produksi H₂S. Untuk sensitivitas maksimum dalam mendeteksi H₂S, agar Sulfide-Indole-Motility (SIM) lebih unggul dari TSIA atau KIA. Uji harus dibaca tepat pada 18-24 jam untuk interpretasi karbohidrat; pembacaan sebelum 18 jam dapat memberikan hasil asam palsu pada bagian miring, sedangkan pembacaan setelah 24 jam dapat menunjukkan kembalinya bagian miring ke alkali bahkan untuk laktosa/sukrosa fermenter. Terakhir, TSIA hanya memberikan identifikasi presumtif dan harus diikuti dengan uji konfirmasi tambahan untuk identifikasi definitif.

Catatan Penting

Beberapa hal penting harus diingat saat melakukan dan menginterpretasi uji TSIA. Tutup harus tetap longgar selama inkubasi untuk mempertahankan kondisi aerobik pada bagian miring; mengencangkan tutup akan menciptakan kondisi anaerobik di seluruh tabung dan membatalkan hasil. Ketika H₂S dalam jumlah besar menutupi reaksi glukosa, fermentasi glukosa tetap harus dicatat sebagai positif karena produksi H₂S memerlukan lingkungan asam. Selalu periksa produksi gas bahkan ketika H₂S menutupi warna dasar, karena gelembung atau retakan mungkin masih terlihat.

Untuk identifikasi Campylobacter, media segar (disiapkan dalam satu minggu) memberikan hasil terbaik; beberapa produsen merekomendasikan menyiapkan KIA segar atau melelehkan dan memadatkan kembali sebelum digunakan untuk organisme ini. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) telah mengusulkan penghapusan kontrol kualitas pengguna untuk TSIA yang dibeli secara komersial, tetapi laboratorium harus memverifikasi ini dengan persyaratan regulasi saat ini sebelum menghentikan prosedur QC.

Jangan pernah menggunakan tabung dengan gelembung yang sudah ada sebelumnya dalam agar, karena ini akan mustahil untuk dibedakan dari produksi gas oleh organisme. Jika penyimpanan diperpanjang diperlukan, beberapa laboratorium lebih suka menyimpan tabung pada suhu ruang (25°C) daripada pendinginan untuk mencegah pembentukan retakan, meskipun ini dapat mengurangi umur simpan. Ketika bekerja dengan organisme yang berpotensi patogen yang diidentifikasi oleh TSIA (seperti Salmonella), selalu ikuti prosedur biosafety yang sesuai dan konfirmasi identifikasi dengan uji tambahan sebelum melaporkan hasil.

Kesimpulan

Uji Triple Sugar Iron Agar tetap menjadi alat yang sangat diperlukan di laboratorium mikrobiologi klinis hampir satu abad setelah pengembangannya. Kemampuannya memberikan beberapa parameter diagnostik dari satu uji menjadikannya sangat berharga untuk identifikasi awal dan skrining bakteri enterik. Uji ini secara efektif membedakan bakteri berdasarkan fermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa, sambil secara bersamaan mendeteksi produksi gas dan hidrogen sulfida.

Meskipun TSIA memiliki keterbatasan—termasuk ketidakmampuan membedakan antara fermentasi laktosa dan sukrosa, potensi penyembunyian reaksi oleh produksi H₂S berat, dan kebutuhan waktu yang tepat dalam pembacaan hasil—media ini tetap sangat berguna ketika diinterpretasi dengan benar dan bersamaan dengan uji lainnya. Kesederhanaan, efisiensi biaya, dan keandalan media telah memastikan penggunaannya yang berkelanjutan di laboratorium modern. Bagi mahasiswa dan peneliti, memahami prinsip biokimia yang mendasari reaksi TSIA memberikan wawasan tentang metabolisme bakteri dan dasar pemikiran untuk desain media diferensial. Sebagai alat skrining, TSIA membantu mempersempit kisaran identifikasi potensial dengan cepat, memungkinkan pengujian konfirmasi yang lebih terarah dan pada akhirnya berkontribusi pada diagnosis mikrobiologi yang akurat dan tepat waktu. Uji ini menggambarkan bagaimana metode mikrobiologi klasik, ketika dipahami dan diterapkan dengan benar, terus memberikan nilai bahkan di era diagnostik molekuler yang semakin canggih.

Referensi

1. Leber, A. L. (2016). Biochemical tests for the identification of aerobic bacteria. In ASM Press eBooks (p. 3.17.1.1-3.17.48.3).
   https://doi.org/10.1128/9781555818814.ch3.17.1.
2. Lehman, D. (2005). Triple Sugar Iron Agar Protocols. American Society for Microbiology.
   https://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.2842.