Pengecatan Leukosit Alkali Fosfatase (Leukocyte Alkaline Phosphatase Stain)

Leukosit Alkali Fosfatase (LAP) merupakan enzim hidrolitik yang terdapat pada granula spesifik neutrofil matur dan granulosit berbentuk pita, dengan kadar yang bervariasi bergantung pada kondisi fisiologis dan patologis pasien (Kaplow, 1955; Bain et al., 2017). Pengukuran aktivitas LAP melalui pewarnaan sitokimia telah lama digunakan sebagai alat diagnostik untuk membedakan berbagai kondisi yang disertai peningkatan jumlah granulosit, khususnya dalam membedakan reaksi leukemoid dari leukemia mielogenus kronik (LMK) (Catovsky & Galton, 1971; Bain et al., 2017).

Prinsip Pemeriksaan

Apusan darah difiksasi menggunakan aseton buffer sitrat untuk mempertahankan aktivitas enzimatik sel secara in situ. Apusan kemudian diinkubasi dalam larutan yang mengandung substrat naftol AS-MX fosfat dan garam diazonium fast blue RR. Alkali fosfatase yang terdapat dalam leukosit akan membebaskan gugus naftol AS-MX dari substrat fosfat melalui hidrolisis enzimatik. Naftol AS-MX yang terlepas segera berikatan dengan fast blue RR membentuk senyawa azo berwarna biru yang tidak larut di tempat aktivitas enzim, sebanding dengan jumlah enzim yang ada (Kaplow, 1955; Brown, 1993; Bancroft & Gamble, 2008). Sediaan kemudian di-counterstain dengan hematoksilin Mayer untuk memvisualisasi inti sel. Derajat reaktivitas ditentukan dengan memberikan skor pada masing-masing 100 neutrofil sesuai intensitas endapan warna yang terbentuk.

Signifikansi Klinis

Skor LAP memberikan informasi diagnostik yang bermakna pada berbagai kondisi hematologis dan non-hematologis (Catovsky & Galton, 1971; Bain et al., 2017).

Peningkatan Skor LAP

Peningkatan aktivitas LAP dijumpai pada reaksi leukemoid, trimester akhir kehamilan dan beberapa hari pertama pascapersalinan, infeksi bakteri disertai neutrofilia, polisitemia vera, anemia aplastik, mieloma multipel, mielosklerosis, ikterus obstruktif, serta pada individu yang menerima terapi kortikosteroid (Kaplow, 1955; Bain et al., 2017). Penyakit Hodgkin menunjukkan hasil pewarnaan yang berkorelasi erat dengan aktivitas penyakit dan cenderung meningkat pada kasus yang belum mendapat pengobatan. Beberapa jenis limfoma limfositik tertentu memperlihatkan aktivitas LAP pada sebagian limfositnya (Catovsky & Galton, 1971).

Penurunan Skor LAP

Penurunan skor LAP secara konsisten dijumpai pada leukemia mielogenus kronik (LMK), yang menjadikan pemeriksaan ini bernilai diagnostik tinggi dalam membedakan LMK dari reaksi leukemoid (Catovsky & Galton, 1971; Bain et al., 2017). Kondisi lain yang disertai penurunan skor LAP meliputi hemoglobinuria nokturnal paroksismal, anemia sel sabit, hipofosfatemia herediter, eosinofilia berat, dan anemia sideroblastik (Kaplow, 1955).

Skor LAP Normal

Aktivitas LAP yang normal umumnya dijumpai pada anemia hemolitik yang tidak diobati, limfosarkoma, hepatitis virus, dan polisitemia sekunder (Bain et al., 2017).

Alat dan Bahan

Alat:

• Stoples Coplin, tiga buah
• Mikroskop cahaya dengan lensa imersi minyak
• Penghitung sel diferensial (differential cell counter)
• Freezer (−20 °C), apabila penyimpanan apusan diperlukan

Gelas ukur dan pipet volume
Bahan:

• Aseton (p.a.)
• Larutan pekat sitrat (Sigma Chemical Co. atau setara)
• Larutan alkali naftol AS-MX fosfat (substrat)
• Garam fast blue RR (kapsul)
• Larutan hematoksilin Mayer 1 g/L
• Air suling
• Spesimen darah kapiler segar atau darah vena dengan antikoagulan heparin

Pembuatan Larutan Kerja Sitrat:

Larutan pekat sitrat sebanyak 2 mL diencerkan dengan air suling hingga volume total 100 mL. Larutan kerja sitrat disimpan di dalam lemari es (2-8 °C). Larutan pekat sitrat induk disimpan pada suhu kamar dan tidak digunakan apabila terdapat tanda kontaminasi yang terlihat secara visual (Kaplow, 1955).

Pembuatan Fiksatif Aseton Buffer Sitrat 60% (b/v):

Fiksatif disiapkan sesaat sebelum digunakan karena tidak stabil. Larutan kerja sitrat yang telah berada pada suhu kamar sebanyak 20 mL ditambahkan ke dalam 30 mL aseton sambil diaduk secara kontinu. Fiksatif yang telah digunakan harus segera dibuang dan tidak dapat digunakan kembali (Kaplow, 1955).

Pembuatan Larutan Pewarna (disiapkan sesaat sebelum digunakan):

Isi satu kapsul fast blue RR dilarutkan ke dalam 48 mL air suling hingga homogen. Larutan alkali naftol AS-MX fosfat sebanyak 2 mL ditambahkan dan diaduk merata. Larutan pewarna yang telah selesai digunakan harus segera dibuang; tidak dapat disimpan untuk penggunaan berikutnya (Kaplow, 1955; Bancroft & Gamble, 2008).

Persiapan Spesimen

Darah kapiler segar merupakan spesimen yang paling direkomendasikan karena menghasilkan aktivitas enzimatik yang optimal (Kaplow, 1955). Apabila darah vena digunakan, heparin merupakan satu-satunya antikoagulan yang dapat diterima; EDTA memiliki efek inhibisi terhadap reaksi pewarnaan dan akan menghasilkan nilai skor yang sangat rendah secara artifisial (Kaplow, 1955; Bain et al., 2017). Apusan dari darah beratikoagulan heparin harus dibuat sesegera mungkin setelah pengambilan spesimen dan diwarnai dalam waktu tidak lebih dari delapan jam.

Tiga jenis apusan disiapkan secara paralel untuk setiap sesi pemeriksaan (Kaplow, 1955):

Apusan Pasien:

Apusan darah kapiler segar dibuat dari jari pasien menggunakan teknik apusan standar dan dikeringkan di udara sebelum fiksasi.

Kontrol Positif:

Apusan dibuat dari darah ibu hamil pada trimester akhir atau beberapa hari pertama pascapersalinan, karena kondisi fisiologis ini menghasilkan aktivitas LAP yang secara konsisten tinggi (Kaplow, 1955).

Kontrol Negatif (Kontrol Normal Diinaktivasi):

Apusan dari individu normal yang telah difiksasi kemudian dimasukkan ke dalam air mendidih selama satu menit untuk menginaktivasi enzim. Kontrol ini berfungsi memverifikasi bahwa warna yang terbentuk pada apusan pasien memang berasal dari aktivitas enzimatik, bukan artefak pewarnaan (Kaplow, 1955).

Penyimpanan Apusan:

Apabila pewarnaan tidak dapat dilakukan dalam delapan jam, apusan yang telah difiksasi dapat disimpan semalam di dalam freezer. Dalam kondisi ini, apusan harus dikeringkan di udara selama satu jam sebelum fiksasi, kemudian dikeringkan kembali selama tiga jam setelah fiksasi sebelum dimasukkan ke dalam freezer (Kaplow, 1955).

Prosedur Pewarnaan

Apusan darah yang telah kering udara ditempatkan ke dalam stoples Coplin yang berisi fiksatif aseton buffer sitrat 60% selama 30 detik. Apusan dibilas secara hati-hati dengan air suling mengalir selama 45 detik; apusan tidak boleh dibiarkan mengering pada tahap ini. Apusan dipindahkan ke dalam stoples Coplin yang berisi larutan pewarna dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah inkubasi, apusan dicuci dengan air suling selama dua menit; apusan tidak boleh dibiarkan mengering. Apusan kemudian di counterstain dengan larutan hematoksilin Mayer 1 g/L selama 10 menit, dibilas dengan air mengalir, dikeringkan di udara, dan siap dibaca di bawah mikroskop (Kaplow, 1955; Bancroft & Gamble, 2008).

Pembacaan dan Sistem Skoring

Pembacaan dilakukan di bawah mikroskop cahaya menggunakan lensa imersi minyak. Seratus neutrofil segmen dan neutrofil pita yang ditemukan secara berurutan dinilai satu per satu; sel-sel lain seperti monosit, limfosit, dan eritrosit tidak diikutsertakan dalam penghitungan skor kecuali terdapat indikasi khusus (Kaplow, 1955; Bain et al., 2017). Setiap neutrofil diberi nilai 0 hingga 4 berdasarkan intensitas dan distribusi endapan warna biru yang terbentuk.

Tabel 1. Sistem skoring aktivitas leukosit alkali fosfatase

Nilai	Deskripsi Pewarnaan
0	Tidak ada endapan warna; sitoplasma tidak berwarna
1+	Endapan difus ringan atau granula halus tersebar; warna biru pucat
2+	Endapan moderat; granula biru sedang memenuhi sebagian sitoplasma
3+	Endapan kuat; granula biru kasar memenuhi sebagian besar sitoplasma
4+	Endapan sangat kuat; granula biru padat memenuhi seluruh sitoplasma, dapat menutupi inti

Diadaptasi dari Kaplow (1955) dan Bain et al. (2017).

Skor total LAP diperoleh dengan menjumlahkan seluruh nilai dari 100 neutrofil yang dinilai, sehingga rentang skor teoritis adalah 0-400. Nilai referensi normal pada orang dewasa umumnya berkisar antara 20-100, namun setiap laboratorium wajib menetapkan nilai referensinya sendiri berdasarkan populasi lokal dan metode yang digunakan (Bain et al., 2017).

Interpretasi Hasil

Tabel 2. Interpretasi skor LAP pada berbagai kondisi klinis

Skor LAP	Kondisi yang Berkaitan
Sangat tinggi (>100)	Reaksi leukemoid, kehamilan trimester akhir, polisitemia vera, anemia aplastik, penyakit Hodgkin aktif, infeksi bakteri, terapi kortikosteroid
Normal (20–100)	Individu sehat, anemia hemolitik tidak diobati, hepatitis virus, polisitemia sekunder
Rendah hingga nol (<20)	Leukemia mielogenus kronik (LMK), hemoglobinuria nokturnal paroksismal, anemia sel sabit, eosinofilia berat, anemia sideroblastik

Diadaptasi dari Catovsky & Galton (1971) dan Bain et al. (2017). Nilai batas referensi bersifat tentatif; setiap laboratorium wajib menetapkan nilai referensinya sendiri.

Pembedaan antara LMK dan reaksi leukemoid merupakan aplikasi klinis utama pemeriksaan LAP. Skor LAP yang sangat rendah atau nol pada pasien dengan leukositosis berat sangat mengarah kepada LMK, sedangkan skor yang sangat tinggi pada kondisi serupa menunjukkan reaksi leukemoid (Catovsky & Galton, 1971; Bain et al., 2017). Perlu dicatat bahwa sejak tersedianya pemeriksaan sitogenetik kromosom Philadelphia (t(9;22)) dan deteksi molekuler BCR-ABL, pemeriksaan LAP tidak lagi menjadi baku emas diagnostik LMK, namun tetap memiliki nilai sebagai pemeriksaan skrining awal di fasilitas dengan sumber daya terbatas (Bain et al., 2017).

Interferan dan Sumber Kesalahan

Penggunaan EDTA sebagai Antikoagulan

EDTA menginhibisi aktivitas alkali fosfatase secara signifikan dan menghasilkan skor yang sangat rendah secara artifisial, sehingga penggunaannya sebagai antikoagulan untuk pemeriksaan LAP merupakan kontraindikasi absolut (Kaplow, 1955).

Penundaan Pembuatan dan Pewarnaan Apusan

Aktivitas enzimatik mengalami penurunan seiring waktu setelah pengambilan darah; penundaan pembuatan apusan dari darah antikoagulan lebih dari delapan jam tanpa fiksasi dapat menyebabkan hasil yang lebih rendah dari nilai sebenarnya (Kaplow, 1955).

Kegagalan Fiksasi

Waktu fiksasi yang tidak tepat atau fiksatif yang telah mengalami degradasi menyebabkan difusi enzim keluar dari sel sehingga pola pewarnaan menjadi tidak akurat (Bancroft & Gamble, 2008).

Kondisi Klinis yang Mempengaruhi Baseline

Terapi kortikosteroid yang sedang berjalan meningkatkan skor LAP secara signifikan tanpa mencerminkan kondisi penyakit yang mendasari; informasi klinis mengenai penggunaan obat ini wajib dicantumkan pada formulir permintaan pemeriksaan (Bain et al., 2017).

Referensi

1. Bain BJ, Bates I, Laffan MA, eds. Dacie and Lewis Practical Haematology. 12th ed. Philadelphia: Elsevier; 2017.
2. Bancroft JD, Gamble M, eds. Theory and Practice of Histological Techniques. 6th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone Elsevier; 2008.
3. Brown BA. Hematology: Principles and Procedures. 6th ed. Philadelphia: Lea & Febiger; 1993.
4. Catovsky D, Galton DAG. Leukocyte alkaline phosphatase (LAP) in lymphoproliferative disorders. Br J Haematol. 1971;20(2):129–138.
5. Kaplow LS. A histochemical procedure for localizing and evaluating leukocyte alkaline phosphatase activity in smears of blood and marrow. Blood. 1955;10(10):1023–1029.
6. Sigma Chemical Co. Leukocyte Alkaline Phosphatase Kit: Procedure No. 86-C. St. Louis, MO: Sigma Chemical Co.; 2001.