Mengenal Jenis Preparat Sumsum Tulang: Teknik Pembuatan dan Zona Baca

Pemeriksaan sumsum tulang (bone marrow examination) merupakan prosedur diagnostik yang memegang peranan krusial dalam evaluasi berbagai kelainan hematologi, baik yang bersifat jinak maupun ganas. Prosedur ini diindikasikan ketika temuan klinis dan hasil laboratorium yang tersedia tidak dapat menjelaskan secara adekuat kelainan hematologi yang ditemukan pada pasien (Lee et al., 2008; Jain & Sharma, 2024).

Evaluasi sumsum tulang yang komprehensif mencakup beberapa komponen yang saling melengkapi, yaitu: aspirasi sumsum tulang (bone marrow aspirate / BMA), biopsi trephine, touch imprint dari inti biopsi trephine, dan dalam kondisi tertentu, clot section (Lee et al., 2008).

Dari spesimen aspirat sumsum tulang, preparat apusan dapat dibuat dengan dua teknik utama, yaitu teknik Squash/Crush dan teknik Spread/Wedge. Kedua teknik tersebut tidak hanya berbeda dalam cara pembuatannya, tetapi juga menghasilkan preparat dengan karakteristik morfologi yang berbeda dan memiliki zona baca (reading zones) yang spesifik:

• Preparat Squash/Crush → zona baca utama: Core
• Preparat Spread/Wedge → zona baca utama: Trail

Menurut rekomendasi resmi International Council for Standardization in Hematology (ICSH), preparat apusan dari aspirat sumsum tulang wajib dibuat dengan kedua teknik secara bersamaan karena keduanya memberikan informasi diagnostik yang saling melengkapi dan tidak dapat saling menggantikan (Lee et al., 2008; Bain et al., 2024).

Gambaran Umum Dua Sumber Spesimen Sumsum Tulang

Perlu dipahami bahwa terdapat dua sumber spesimen sumsum tulang yang berbeda, masing-masing menghasilkan jenis preparat yang berbeda pula (Jain & Sharma, 2024; Bain et al., 2024):

1. Aspirasi Sumsum Tulang (Bone Marrow Aspiration / BMA)

Aspirasi sumsum tulang merupakan prosedur pengambilan suspensi cair dari rongga sumsum tulang menggunakan jarum aspirasi khusus. Aspirat yang diperoleh mengandung sel-sel hematopoietik bebas dan partikel sumsum (spicules/particles), yaitu fragmen jaringan sumsum tulang yang menjadi bahan utama untuk pembuatan preparat Squash/Crush dan Spread/Wedge.

2. Biopsi Trephine (Trephine Core Biopsy)

Biopsi trephine merupakan prosedur pengambilan inti jaringan padat sumsum tulang menggunakan jarum Jamshidi (ukuran 8-11 gauge untuk dewasa, 13 gauge untuk anak). Inti jaringan yang diperoleh menjadi bahan untuk pembuatan preparat Touch Imprint (Jain & Sharma, 2024).

Biopsi trephine dilakukan setelah prosedur aspirasi selesai, untuk mencegah kontaminasi aspirat oleh darah perifer akibat trauma jarum biopsi pada area yang sama (Jain & Sharma, 2024).

Preparat Squash / Crush

Nama lain: Crush preparation, Squash preparation, Particle crush smear, Spicule crush
Spesimen: Partikel (spicule) dari aspirat sumsum tulang
Zona baca utama: Core

Prinsip

Preparat squash dibuat dengan cara memilih partikel sumsum tulang (spicules) secara selektif dari aspirat, kemudian menghancurkan dan meratakan partikel tersebut di antara dua kaca objek. Teknik ini memungkinkan pengamatan sel-sel hematopoietik dalam konteks yang mendekati unit arsitektur sumsum tulang aslinya, meskipun tidak sepenuhnya terjaga (Bain et al., 2024; Ahluwalia et al., 2021).

Prosedur

1. Segera setelah aspirasi, aspirat diteteskan di atas permukaan cawan Petri atau kaca objek bersih.
2. Partikel sumsum tulang yang tampak sebagai butiran keputihan atau kecoklatan, dipilih secara selektif menggunakan pipet Pasteur; kelebihan darah perifer dibuang.
3. Partikel yang telah dipilih dipindahkan ke atas kaca objek yang bersih dan kering.
4. Kaca objek kedua diletakkan secara paralel dan langsung di atas partikel. Berat kaca objek kedua sudah cukup sebagai tekanan; tekanan tambahan ke arah bawah tidak diperlukan (Lee et al., 2008).
5. Kedua kaca objek ditarik ke arah yang berlawanan secara lateral untuk meratakan partikel yang telah dihancurkan.
6. Preparat dibiarkan mengering di udara, kemudian difiksasi dengan metanol, dan diwarnai dengan pewarnaan Romanowsky (May-Grünwald-Giemsa atau Wright-Giemsa).

Zona Baca: Core

Core merupakan zona baca utama pada preparat squash, yaitu area di sekitar dan di dalam fragmen sumsum tulang yang telah dihancurkan. Pada preparat squash, partikel yang telah dihancurkan terletak di bagian tengah kaca objek (center of the slide) (Ahluwalia et al., 2021). Pada zona tersebut, sel-sel hematopoietik yang sebelumnya terjebak di dalam partikel sumsum tulang akan terekspos dan dapat diamati secara mikroskopis.

Menurut panduan ICSH (Lee et al., 2008), preparat squash digunakan terutama untuk:

• Evaluasi jumlah dan morfologi megakariosit
• Deteksi penyakit fokal (limfoma, mieloma, granuloma, mastositosis)
• Penilaian fibrosis sumsum tulang
• Identifikasi sel abnormal yang terjebak di dalam partikel sumsum
• Penilaian selularitas, namun dengan catatan: karena partikel dihancurkan, sel-sel yang sebelumnya terjebak di dalam partikel akan terperas keluar secara keseluruhan, sehingga zona core tampak lebih padat daripada kondisi aslinya. Ahluwalia et al. (2021) membuktikan secara statistik bahwa squash melebihi estimasi (overestimate) selularitas secara bermakna dibandingkan spread (p < 0,05)

Keunggulan Preparat Squash/Crush

• Minimal efek dilusi darah perifer, karena hanya partikel yang dipilih secara selektif, kontaminasi dengan darah perifer sangat minimal sehingga representasi sel sumsum tulang lebih murni (Bain et al., 2024)
• Evaluasi megakariopoiesis lebih baik secara kualitatif dibandingkan spread (Ahluwalia et al., 2021)
• Arsitektur sumsum tulang sebagian terjaga, sel-sel dapat diamati dalam konteks unit fragmentnya
• Pewarnaan besi (Prussian Blue) dapat dilakukan untuk evaluasi simpanan besi sumsum dan identifikasi sideroblast (Lee et al., 2008)
• Dapat dibuat dari aspirat dalam EDTA sebagai alternatif apabila aspirat asli membeku sebelum preparat selesai dibuat (Lee et al., 2008)

Keterbatasan Preparat Squash/Crush

• Overestimasi selularitas, penghancuran partikel menyebabkan selularitas dinilai secara signifikan lebih tinggi dari kondisi sesungguhnya (p < 0,05) (Ahluwalia et al., 2021)
• Memerlukan keterampilan teknis lebih tinggi, pemilihan partikel yang tepat dan kontrol tekanan yang sesuai memerlukan pengalaman yang cukup
• Artefak crush, tekanan yang berlebihan dapat merusak sel dan menghambat interpretasi morfologi

Preparat Spread / Wedge

Nama lain: Wedge-spread preparation, Wedge smear, Spread preparation, Direct smear, Aspirate smear
Spesimen: Aspirat sumsum tulang (seluruh tetes)
Zona baca utama: Trail

Prinsip

Teknik spread/wedge dilakukan dengan menyebarkan setetes aspirat sumsum tulang di atas kaca objek menggunakan kaca spreader yang digerakkan dengan sudut tertentu, prinsipnya serupa dengan teknik pembuatan apusan darah tepi (peripheral blood smear). Selama proses penyebaran, partikel sumsum tulang akan terseret ke arah ekor apusan (tail end) dan meninggalkan jejak seluler (cellular trail) di sepanjang jalur pergerakannya (Ahluwalia et al., 2021; Bain et al., 2024).

Prosedur

1. Setetes kecil aspirat (mengandung partikel) diteteskan sekitar 1 cm dari ujung kaca objek yang bersih, segera setelah aspirasi dilakukan.
2. Kaca spreader ditempatkan di depan tetesan dengan sudut 30-45°.
3. Kaca spreader ditarik ke belakang hingga menyentuh tepi tetesan, sehingga aspirat menyebar secara merata di sepanjang tepi bawah kaca spreader.
4. Kaca spreader didorong ke depan dengan gerakan yang halus, merata, dan konsisten untuk menyebarkan aspirat membentuk apusan.
5. Preparat dibiarkan mengering di udara, kemudian difiksasi dan diwarnai dengan pewarnaan Romanowsky.

Pembuatan apusan aspirat direkomendasikan dilakukan langsung di sisi tempat tidur pasien (bedside preparation) untuk meminimalkan artefak akibat penundaan (Jain & Sharma, 2024).

Zona Baca: Trail

Trail, secara harfiah berarti "jejak", merupakan zona baca utama pada preparat spread/wedge. Panduan ICSH (Lee et al., 2008) mendefinisikannya secara eksplisit sebagai berikut:

"Areas of well-spread marrow cells in the cellular trails of the BM smear behind the particles are selected for assessment at higher magnification (×200, ×400, ×600, ×1000) for morphological assessment of cells, including cytological detail, parasites or cell inclusions."
— ICSH Guidelines (Lee et al., 2008)

Zona trail terbentuk karena selama proses penyebaran aspirat, partikel sumsum yang lebih berat terseret ke ekor kaca objek, sementara sel-sel yang lebih ringan tertinggal tersebar secara tipis dan merata di sepanjang jalur pergerakan partikel tersebut. Pada preparat spread, partikel terletak di ujung ekor (tail end) kaca objek (Ahluwalia et al., 2021).

Kušec et al. (2012) mengonfirmasi bahwa pada preparat wedge, differential count dilakukan "in the areas just before the marrow particles", yaitu di zona trail, di mana partikel masih terlihat dalam kondisi utuh sebagai kerangka acuan penilaian selularitas.

Zona trail menjadi area utama untuk:

• Hitung diferensial (differential count) 500 sel hematopoietik
• Penilaian morfologi sitologis detail setiap jenis sel (eritroid, mieloid, limfoid, sel plasma)
• Identifikasi parasit atau inklusi intraseluler
• Estimasi selularitas yang lebih akurat, karena partikel masih berada dalam kondisi utuh (intact), rasio sel hematopoietik terhadap sel lemak di dalam partikel masih terjaga sesuai kondisi aslinya (Ahluwalia et al., 2021; Kušec et al., 2012)

Cara Membaca Preparat Spread/Wedge secara Sistematis

Berdasarkan panduan ICSH (Lee et al., 2008), evaluasi preparat spread/wedge dilakukan dalam dua tahap:

1. Pemindaian awal dengan perbesaran rendah (×100), selularitas partikel dinilai, jumlah megakariosit dihitung, dan keberadaan kelompok sel abnormal (clumps) atau sel insidensi rendah diidentifikasi.
2. Pemeriksaan zona trail dengan perbesaran tinggi (×200–×1000), morfologi detail setiap seri sel dinilai dan hitung diferensial 500 sel dilakukan.

Keunggulan Preparat Spread/Wedge

• Morfologi sel individual paling optimal, distribusi sel yang tipis dan merata di zona trail menghasilkan gambaran morfologi sitologis yang paling baik di antara semua jenis preparat aspirat (Sharma et al., 2014)
• Estimasi selularitas lebih akurat, karena partikel sumsum tulang masih dalam kondisi utuh pada preparat spread, rasio sel hematopoietik terhadap sel lemak di dalam partikel masih terjaga sesuai kondisi aslinya. Hal ini berbeda dengan squash, di mana penghancuran partikel menyebabkan seluruh sel terperas keluar sehingga zona core tampak lebih seluler dari kondisi sesungguhnya. Ahluwalia et al. (2021) membuktikan secara statistik bahwa squash melebih-estimasi selularitas secara bermakna dibandingkan spread (p < 0,05)
• Hitung diferensial lebih reproducible, dilakukan secara konsisten di zona trail (Kušec et al., 2012)
• Teknik lebih mudah dipelajari, prinsip dasarnya serupa dengan pembuatan apusan darah tepi yang sudah dikenal luas
• Dapat dibuat langsung di sisi pasien sehingga meminimalkan waktu antara pengambilan dan pembuatan preparat
• Keunggulan morfologis terbukti ketika preparat dibuat tepat waktu (timely wedge smear) (Sharma et al., 2014)

Keterbatasan Preparat Spread/Wedge

• Efek dilusi darah perifer yang bermakna, seiring bertambahnya volume aspirat yang diambil, terjadi dilusi progresif dengan darah perifer yang mengurangi representasi sel sumsum sejati (Lee et al., 2008)
• Underestimasi selularitas relatif, dibandingkan squash, spread cenderung memberikan estimasi selularitas yang lebih rendah karena sel tersebar lebih luas di area yang lebih besar (Ahluwalia et al., 2021)
• Kurang ideal untuk deteksi lesi fokal, penyakit dengan distribusi fokal seperti limfoma, mieloma, dan granuloma lebih mudah terlewat pada preparat spread dibandingkan squash (Ahluwalia et al., 2021)
• Arsitektur sumsum tulang tidak terjaga, sel-sel terpisah dari konteks struktural partikelnya

Core Touch Imprint (Trephine Biopsy Touch Imprint)

Nama lain: Touch imprint, Imprint smear, Biopsy imprint, Roll preparation
Spesimen: Inti biopsi trephine, bukan aspirat

Prinsip

Preparat touch imprint dibuat dengan cara menyentuhkan atau menggulingkan permukaan inti biopsi trephine yang masih segar ke atas permukaan kaca objek. Sel-sel yang melekat pada permukaan inti biopsi akan tertinggal membentuk impresi seluler di atas kaca objek. Teknik ini memungkinkan perolehan gambaran sitologi dari jaringan padat sumsum tulang tanpa melalui proses dekalsifikasi dan processing histologi yang membutuhkan waktu lebih lama (Bain et al., 2024; Jain & Sharma, 2024).

Prosedur

1. Segera setelah inti biopsi trephine diperoleh, inti biopsi segar diletakkan di atas kaca objek yang bersih sebelum dimasukkan ke dalam larutan fiksatif.
2. Permukaan inti biopsi disentuhkan secara perlahan dan lembut ke permukaan kaca objek, tekanan berlebihan harus dihindari untuk mencegah crush artifact.
3. Untuk meningkatkan representasi keterlibatan fokal, inti biopsi dapat digulingkan (rolling technique) secara perlahan di atas kaca objek sehingga impresi sel terbentuk dari hampir seluruh sisi permukaan inti (Panicker et al., 2012).
4. Sebanyak 2–3 kaca objek disiapkan dengan beberapa titik imprint pada masing-masing kaca.
5. Preparat dibiarkan mengering di udara terlebih dahulu sebelum difiksasi dengan metanol, kemudian diwarnai dengan pewarnaan Romanowsky.
6. Beberapa kaca objek dibiarkan tanpa pewarnaan untuk kemungkinan pemeriksaan imunostaining, pewarnaan sitokimia, atau FISH (Lee et al., 2008).

Keunggulan Core Touch Imprint

• Tidak terpengaruh dry tap, merupakan satu-satunya sumber untuk evaluasi sitologi apabila aspirasi gagal memperoleh partikel (dry tap) (Jain & Sharma, 2024)
• Hasil awal yang cepat, gambaran sitologi awal dapat diperoleh dalam hitungan menit, jauh sebelum proses histologi selesai
• Deteksi keterlibatan fokal lebih sensitif, sebanyak 93,3% kasus tumor padat metastatik dapat terdiagnosis pada imprint, dibandingkan hanya 70% pada aspirat (Panicker et al., 2012)
• Akurasi diagnostik imprint mencapai 83,7% lebih tinggi dibandingkan aspirat (77,5%), meskipun masih di bawah biopsi histologi (99,2%) (Panicker et al., 2012)
• Korelasi dengan biopsi histologi lebih tinggi (84,3%) dibandingkan korelasi antara aspirat dengan biopsi (78%) (Panicker et al., 2012)
• Tanpa artefak dekalsifikasi antigenisitas sel tetap terjaga untuk keperluan imunohistokimia

Keterbatasan Core Touch Imprint

• Crush artifact apabila inti biopsi ditekan terlalu keras ke kaca objek
• Tidak menggantikan biopsi histologi dalam penilaian arsitektur jaringan tiga dimensi
• Representasi sel terbatas pada permukaan inti, sel-sel di bagian dalam inti tidak dapat terimprint

Perbandingan Ketiga Jenis Preparat

Karakteristik	Squash/Crush	Spread/Wedge	Core Touch Imprint
Sumber spesimen	Partikel aspirat (dipilih selektif)	Seluruh tetes aspirat	Inti biopsi trephine
Cara pembuatan	Partikel dihancurkan antara 2 kaca, ditarik lateral	Aspirat disebarkan dengan kaca spreader sudut 30-45°	Inti biopsi disentuhkan/digulingkan ke kaca objek
Lokasi partikel pada slide	Tengah slide (center)	Terseret ke ekor slide (tail end)	Tidak relevan (bukan aspirat)
Zona baca utama	Core, sekitar fragmen yang dihancurkan	Trail, di belakang dan sekitar partikel yang utuh	Seluruh area imprint
Perbesaran zona baca	×100 - ×400	×100 (pemindaian), ×200 - ×1000 (zona trail)	×100 - ×1000
Kegunaan zona baca	Megakariosit, deteksi fokal, fibrosis, sel abnormal terjebak partikel	Morfologi detail, differential count 500 sel, estimasi selularitas akurat	Sitologi cepat, evaluasi saat dry tap
Kondisi partikel	Hancur (crushed)	Utuh (intact)	Tidak relevan
Estimasi selularitas	Overestimasi bermakna (p < 0,05)	Lebih akurat (partikel utuh)	Terbatas
Morfologi sel individual	Baik	Paling optimal	Baik (jika tanpa crush artifact)
Deteksi lesi fokal	Lebih baik	Dapat terlewat	Paling sensitif (93,3%)
Efek dilusi darah perifer	Minimal	Bermakna	Tidak ada
Kegunaan saat dry tap	Tidak dapat dilakukan	Tidak dapat dilakukan	Pilihan utama
Rekomendasi ICSH	Wajib	Wajib	Sangat direkomendasikan

Diskrepansi Diagnostik antara Squash dan Wedge

Studi komparatif Ahluwalia et al. (2021) yang melibatkan 205 pasien melaporkan temuan berikut:

• Konkordansi diagnostik keseluruhan antara squash dan wedge mencapai 91,7% (188 dari 205 kasus)
• Diskrepansi mayor tercatat pada 3,9%kasus, paling sering dijumpai pada penyakit dengan distribusi fokal, yaitu limfoma, mieloma, dan granuloma tuberkulosis
• Squash terbukti secara signifikan melebih estimasi selularitas dan jumlah megakariosit dibandingkan wedge (p < 0,05)
• Tidak ditemukan perbedaan bermakna pada rasio mieloid:eritroid (M:E ratio) antara kedua teknik

Temuan tersebut memperkuat argumen mengapa ICSH mewajibkan penggunaan kedua teknik secara bersamaan, keduanya memberikan informasi yang saling melengkapi dan tidak dapat saling menggantikan satu sama lain.

Kesimpulan

Terdapat dua teknik pembuatan preparat aspirat sumsum tulang yang direkomendasikan secara internasional oleh ICSH, yaitu Squash/Crush dan Spread/Wedge. Kedua teknik tersebut tidak hanya berbeda dalam cara pembuatannya, tetapi juga memiliki zona baca yang spesifik dan berbeda satu sama lain:

• Preparat Squash/Crush dibaca di zona Core, area di sekitar fragmen sumsum yang telah dihancurkan, terutama digunakan untuk evaluasi megakariopoiesis, deteksi penyakit fokal, penilaian fibrosis, dan identifikasi sel abnormal yang terjebak dalam partikel. Perlu diperhatikan bahwa squash cenderung melebihi estimasi selularitas secara bermakna akibat penghancuran partikel yang menyebabkan sel terperas keluar dari konteks aslinya (Ahluwalia et al., 2021).
• Preparat Spread/Wedge dibaca di zona Trail, area seluler yang terbentuk di belakang dan sekitar partikel yang masih utuh, sesuai definisi ICSH (Lee et al., 2008). Zona ini digunakan untuk penilaian morfologi sitologis detail, hitung diferensial 500 sel, serta estimasi selularitas yang lebih akurat karena proporsi sel hematopoietik terhadap lemak dalam partikel masih terjaga dalam kondisi aslinya.
• Preparat Core Touch Imprint dari biopsi trephine melengkapi kedua preparat tersebut dan menjadi satu-satunya pilihan pada kondisi dry tap.

Pemahaman yang mendalam tentang zona baca masing-masing preparat sangat penting dalam praktik hematologi laboratorium, karena evaluasi yang dilakukan di zona yang tidak tepat berpotensi menghasilkan interpretasi yang tidak akurat dan secara langsung mempengaruhi keputusan diagnostik dan klinis.

Referensi

1. Lee, S.-H., Erber, W.N., Porwit, A., Tomonaga, M., & Peterson, L.C. (2008). ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology, 30(5), 349–364. DOI: 10.1111/j.1751-553X.2008.01100.x
2. Ahluwalia, N.A., Kakkar, N., & Kwatra, K.S. (2021). A comparative study of bone marrow squash and wedge aspiration smears. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion, 37(1), 108–118. DOI: 10.1007/s12288-020-01321-9
3. Bain, B.J., Clark, D.M., & Wilkins, B.S. (2024). Bone Marrow Pathology (6th ed.). Wiley-Blackwell.
   
4. Jain, S., & Sharma, R. (2024). Laboratory Evaluation of Bone Marrow. In StatPearls. Treasure Island, FL: StatPearls Publishing.
   
5. Sharma, P., Sachdeva, M.U., & Varma, N. (2014). Bone marrow aspirate smear preparation: morphological superiority of the timely wedge smear and the importance of imprints. Annals of Hematology, 93(6), 1063–1064. DOI: 10.1007/s00277-013-1904-9
6. Kušec, R., Batinić, D., Dominis, M., & Jaksić, B. (2012). Microscopic examination of bone marrow aspirates in malignant disorders of haematopoiesis a comparison of two slide preparation techniques. Annals of Hematology, 91(8), 1245–1252. DOI: 10.1007/s00277-011-1347-4
7. Panicker, J., Thomas, M., Jayaraju, M., Patil, A., & Hari Menon, V. (2012). Comparison of bone marrow aspirate cytology, touch imprint cytology and trephine biopsy for bone marrow evaluation. Indian Journal of Pathology and Microbiology, 55(1), 9–13.
8. Bain, B.J. (2001). Bone marrow aspiration. Journal of Clinical Pathology, 54(9), 657–663. DOI: 10.1136/jcp.54.9.657
9. Rodak, B.F., Fritsma, G.A., & Keohane, E.M. (2020). Hematology: Clinical Principles and Applications (6th ed.). Elsevier/Saunders.