Uji Indol Pada Bakteri - Indole Test — Online Text Book ATLM

Pendahuluan

Uji indol digunakan untuk menentukan apakah suatu spesies bakteri dapat mengubah asam amino triptofan menjadi asam piruvat, amoniak, dan indol. Tryptophan atau peptone broth adalah media yang digunakan untuk uji indol. Pengujian dilakukan dengan menginokulasi media dengan bakteri, diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Media yang digunakan tidak mengandung pewarna dan mengandung triptofan, misalnya BAP (Blood Agar Plate), CHOC (Chocolate agar) atau CBA (chocolate blood agar).

Selain media plate dapat juga diuji menggunakan media SIM (Sulphide Indole Motility), yang merupakan media diferensial semi-solid yang menguji tiga parameter termasuk reduksi sulfur, produksi indol, dan motilitas. Media ini terdiri dari berbagai nutrisi, besi, natrium tiosulfat, dan pepton, yang mengandung triptofan. Saat melakukan uji ini, hasil uji belerang dan motilitas harus dianalisis sebelum uji indol. Jika suatu organisme mampu mereduksi belerang menjadi hidrogen sulfida, maka akan terbentuk endapan hitam. Endapan ini dihasilkan ketika hidrogen sulfida bergabung dengan besi untuk membentuk besi sulfida. Dengan demikian, jika ada yang menghitam pada media, itu menunjukkan bahwa organisme tersebut mampu mereduksi belerang.

Motilitas dapat dianalisis dengan mengamati kekeruhan agar semi-solid. Jika agar tampak keruh, hal ini menunjukkan bahwa mikroorganisme mampu menjauh dari tusukan agar; ini adalah tes positif untuk motilitas. Jika suatu organisme tidak bergerak, ia akan tetap berada dalam tusukan. Beberapa mikroorganisme memiliki kemampuan untuk menghidrolisis triptofan menggunakan enzim yang disebut triptofanase. Produk sampingan dari reaksi ini meliputi indol, piruvat, dan amonium. Untuk menganalisis kultur untuk produksi indol, reagen Kovac ditambahkan ke media SIM. Reagen ini mengandung asam klorida, p-dimethylaminobenzaldehyde (DMABA), dan n-amyl alcohol. Jika indol diproduksi, ia bereaksi dengan DMABA untuk membentuk senyawa quinoidal merah. Jadi, jika cincin merah terbentuk di permukaan agar-agar, itu menunjukkan reaksi indol positif. Tidak ada perubahan warna yang menunjukkan tes negatif. Selain metode Kovac ada metode lain yang akan dijelaskan dibawah ini, sebelum memluai pemeriksaan berikut persiapan reagen yang akan digunakan.

Persiapan Reagen
Perhatian: HCl beracun dan terbakar. Buat reagen indol di lemari asam. Tambahkan asam ke air, jangan menambahkan air ke asam.

Reagen Ehrlich

p-dimethylaminobenzaldehyde	1 g
ethyl alcohol, 95%	95 ml
hydrochloric acid, concentrated	20 ml

Larutkan aldehida dalam alkohol (ini mungkin memerlukan pemanasan yang lembut).
Bekerja di bawah lemari asam, perlahan tambahkan asam (jangan pernah menambahkan alkohol ke asam), Campur.
Reagen harus berwarna kuning pucat dan stabil selama 1 tahun.

Reagen Kova´cs

p-dimethylaminobenzaldehyde	10 g
isobutyl or isoamyl alcohol (absolute)	150 ml
hydrochloric acid, concentrated	50 ml

Larutkan aldehida dalam alkohol (ini mungkin memerlukan pemanasan yang lembut).
Bekerja di bawah lemari asam, perlahan tambahkan asam (jangan pernah menambahkan alkohol ke asam), Campur.
Reagen harus berwarna kuning pucat dan stabil selama 1 tahun

5% p-Dimethylaminobenzaldehyde

p-dimethylaminobenzaldehyde	5 g
10% (vol/vol) hydrochloric acid	100 ml

Tambahkan 10 ml HCl pekat ke dalam 90 ml air.
Larutkan aldehida dalam asam (gunakan lemari asam).
Umur simpan adalah 4 bulan.

1% p-Dimethylaminocinnamaldehyde

p-dimethylaminobenzaldehyde	1 g
10% (vol/vol) hydrochloric acid	100 ml

Tambahkan 10 ml HCl ke dalam 90 ml air.
Larutkan aldehida dalam asam (gunakan lemari asam).
Umur simpan adalah 2 bulan.

Prosedur

Siapkan sterile loop, swab, atau ose mata, ose jarum, bunsen, dan kertas saring (opsional). Siapkan Bakteri yang akan diuji misalnya bakteri Gram-negatif pada media yang tidak mengandung pewarna dan mengandung triptofan, misalnya BAP atau CHOC, batang Gram-positif anaerobik dan atau batang Gram-negatif anaerobik.

Langkah kerja
Indol spot tes cepat (Rapid spot indole)
Gunakan salah satu metode di bawah ini. Jangan gunakan reagen spot benzaldehida untuk anaerob.

Basahi kertas saring dengan reagen. Menggunakan tongkat kayu, gosok bagian koloni ke atas kertas.
Sapu koloni ke swab. Tambahkan setetes reagen indol ke usap koloni.
Tambahkan reagen langsung ke koloni yang tumbuh pada permukaan agar.

Uji tabung

Inokulasi media tabung cair atau media agar tusuk dengan koloni.
Inkubasi selama 18-24 jam. Jika kaldu digunakan untuk produksi indol, tuang sebagian media ke tabung kedua sebelum pengujian.
-Metode Ehrlich - untuk bakteri anaerob dan produsen indol lemah
1. Tambahkan 0,5 ml xilena ke dalam tabung dan balikkan hingga tercampur. Biarkan menetap.
2. Tambahkan 6 tetes reagen indole Ehrlich di sisi tabung dan amati warna di bawah lapisan xilena.
-Metode Kovacs - untuk organisme yang tumbuh secara aerobik
1. Tambahkan 3-5 tetes reagen Kovacs di sisi tabung dan amati perubahan warna pada meniskus.
2. Jika tes negatif, ulangi tes setelah 24 jam inkubasi tambahan, jika diinginkan.

Pembacaan Hasil
Perkembangan warna coklat-merah menjadi ungu-merah (pereaksi benzaldehida) atau warna biru (pereaksi sinamaldehida) dalam waktu 20 detik menunjukkan adanya indol. Tes negatif tidak berwarna atau agak kuning.
Contoh bakteri hasil tes positif E. coli adalah indole positif, seperti banyak Enterobacteriaceae, Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, dan lainnya. Sedangkan Delftia acidovorans menghasilkan reaksi jingga labu dari produksi asam antranilat, bukan indol, dari triptofan dengan reagen Kova´cs.

Catatan:

Biakan yang akan diuji produksi indolnya perlu diinkubasi secara aerobik dan pH optimum untuk aktivitas triptofanase adalah basa (pH 7,4–7,8), sehingga jika terjadi penurunan pH dalam penurunan produksi indol dan memberikan kemungkinan reaksi negatif palsu.
Indol yang terdeteksi akan berdifusi ke koloni dalam jarak 5 mm dari koloni 2 hingga 3 mm, memberikan hasil positif palsu.
Jangan gunakan media yang mengandung pewarna (mis., EMB (Eosin Methylene Blue Agar), MAC (MacConkey agar)).
Media tumbuh harus mengandung triptofan dalam jumlah yang cukup. Jangan gunakan agar Mueller-Hinton untuk pengujian, karena triptofan dihancurkan selama hidrolisis asam kasein.
Hanya reagen cinnamaldehyde yang dapat digunakan untuk pengujian tempat mikroorganisme anaerobik. Ini adalah reagen yang lebih sensitif, tetapi kurang stabil.
Jangan menggunakan piring dengan disk nitrat untuk melakukan uji indol, karena nitrat dapat mengganggu uji indol spot dengan menginduksi hasil negatif palsu.
Jika uji indole cepat negatif, isolat dapat menjadi positif pada uji tabung yang lebih sensitif. Ekstraksi dengan xilena adalah tes yang paling sensitif. Pengganti xilena kurang sensitif.

Ilustrasi

Pustaka

Amy L. Leber, 2016, Clinical Microbiology Procedures Handbook, 4th edition, American Society for Microbiology.
Subhash Chandra Parija, 2012. Textbook of Microbiology and Immunology, Second Edition, Elsevier
American Type Culture Collection (ATCC®), 2015, Introduction to Microbiology, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110