Menentukan Berat Molekul (BM) pada Gel SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) merupakan metode yang sering digunakan untuk menentukan berat molekul (molecular weight, MW) dari protein yang tidak diketahui. Langkah awal dalam penentuan berat molekul ini adalah memisahkan sampel protein pada gel yang sama dengan standar berat molekul (MW standards). Selanjutnya, grafik hubungan antara log MW dan jarak migrasi relatif (relative migration distance, Rf) dibuat berdasarkan nilai pita protein pada standar MW. Berat molekul protein yang tidak diketahui kemudian dihitung melalui interpolasi menggunakan grafik tersebut. Kunci keberhasilan dalam menentukan berat molekul secara akurat adalah memilih kondisi pemisahan yang menghasilkan hubungan linear antara log MW dan migrasi dalam rentang MW protein yang dianalisis.

Prinsip Dasar SDS-PAGE

SDS adalah deterjen ionik yang berfungsi untuk:

• Mendenaturasi struktur sekunder, tersier, dan kuartener protein.
• Memberikan muatan negatif pada protein sehingga rasio muatan terhadap massa menjadi konstan.

Dengan demikian, protein bermigrasi melalui gel berdasarkan berat molekulnya saja. Protein dengan berat molekul lebih kecil akan bergerak lebih jauh dibandingkan yang lebih besar.

Kondisi SDS-PAGE untuk Penentuan Berat Molekul

Agar penentuan berat molekul akurat, baik standar protein maupun protein yang tidak diketahui harus dielektroforesis pada gel yang sama dengan kondisi pemisahan yang identik. Selain itu, penting untuk mengumpulkan beberapa data (minimal tiga gel) agar estimasi berat molekul memiliki signifikansi statistik. Larutan buffer sampel yang digunakan untuk melarutkan protein harus mengandung agen pereduksi seperti ditiotreitol (DTT) atau β-merkaptoetanol untuk memutus ikatan disulfida. Hal ini bertujuan meminimalkan pengaruh struktur sekunder terhadap migrasi.

Langkah-Langkah Penentuan Berat Molekul

1. Persiapan Sampel dan Standar
   Sampel protein dan standar berat molekul (standar MW) dimuat pada gel SDS-PAGE yang sama untuk memastikan kondisi identifikasi identik.
2. Elektroforesis
   Protein dipisahkan dalam gel berdasarkan massa molekulnya di bawah pengaruh medan listrik.
3. Pewarnaan dan Visualisasi
   Gel pewarnaan (misalnya dengan pewarna Coomassie) untuk memvisualisasikan pita protein.
4. Pengukuran Jarak Migrasi
   Jarak migrasi setiap pita protein diukur dari bagian atas gel hingga pita tersebut.
5. Perhitungan Nilai Rf
   Nilai Rf dihitung menggunakan rumus:
   $$ R_f = \frac{\text{Jarak migrasi protein}}{\text{Jarak migrasi zat warna}} $$
6. Pembuatan Standar Kurva
   Plot grafik log MW standar terhadap nilai Rf. Jika hubungan antara log MW dan Rf linear, gunakan persamaan garis lurus (y = mx + b) untuk menentukan sampel protein log MW dari nilai Rf-nya.
7. Interpolasi Berat Molekul
   Berat molekul sampel dihitung dengan mengkonversi log MW menjadi nilai MW menggunakan eksponensial: $$ MW = 10^{\text{log MW}} $$

Contoh Perhitungan

Misalkan jarak migrasi protein sampel adalah 45 mm, sedangkan pewarna depan adalah 67 mm: $$ R_f = \frac{45}{67} = 0,67 $$ Dari kurva standar, persamaan garis lurus diperoleh: $$ y = -1,9944x + 2,7824 $$ Substitusi x = Rf = 0,67: $$ y = -1,9944(0,67) + 2,7824 = 1,45 $$ Berat molekul dihitung sebagai: $$ MW = 10^{1.45} \approx 28.1 \, \text{kDa} $$

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Akurasi

Beberapa faktor dapat mempengaruhi penentuan hasil berat molekul:

• Struktur Protein: Modifikasi pascatranslasi atau kandungan asam amino tertentu (misalnya glikoprotein atau protein asam) dapat mempengaruhi migrasi.
• Linearitas Kurva Standar: Hubungan log MW terhadap Rf harus linear untuk hasil yang akurat (r2 > 0.99).
• Kondisi Eksperimen: Kondisi elektroforesis harus seragam untuk semua sampel dan standar.

Keterbatasan SDS-PAGE

Meskipun SDS-PAGE adalah metode yang umum digunakan, hasilnya memiliki tingkat kesalahan hingga ±10%. Untuk akurasi yang lebih tinggi, penentuan berat molekul dapat dilanjutkan dengan spektrometri massa.

Referensi

1. Hames BD (ed), (1998), Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, 3rd edn, Oxford University Press, Oxford, New York
2. Bio-Rad, (2004), Molecular Weight Determination by SDS-PAGE, Electrophoresis, Tech note 3133, Bulletin 3133 US/EG Rev A, Bio-Rad Laboratories, Inc.