Immunohistochemistry (IHC): Prinsip, Metode, dan Aplikasi dalam Histologi dan Sitologi

Imunohistokimia (IHC) adalah teknik untuk pengenalan visual antigen yang terdapat dalam jaringan dengan bantuan antibodi yang sesuai. Sejarah IHC dapat ditelusuri kembali ke saat Coon dkk. pertama kali menerapkan teknik imunofluoresensi pada irisan beku menggunakan antibodi yang dilabeli fluoresensi. Kemajuan signifikan terjadi pada tahun 1967 ketika Nakane dkk. memperkenalkan antibodi yang dikonjugasi dengan enzim seperti fosfatase asam dan peroksidase lobak. Teknik ini berhasil diterapkan untuk bagian formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) rutin oleh Taylor dkk. pada tahun 1974. Pengembangan antibodi monoklonal lebih lanjut merevolusi imunohistokimia, meskipun diperlukan waktu 10-15 tahun sebelum IHC menjadi teknik esensial di laboratorium patologi.

Tujuan dan Aplikasi

IHC telah menjadi alat yang tak tergantikan dalam patologi diagnostik dengan berbagai aplikasi.
Aplikasi Diagnostik:

• Deteksi tumor primer yang tidak diketahui
• Klasifikasi tumor sel bulat ganas
• Pembedaan karsinoma, sarkoma, dan melanoma
• Diagnosis keganasan pada sampel efusi
• Subklasifikasi karsinoma paru dan limfoma
• Diagnosis neoplasma jaringan lunak

Aplikasi Prognostik:

• Analisis proliferasi sel
• Penilaian status reseptor hormon
• Evaluasi penanda prognostik

Aplikasi Terapeutik:

• Studi reseptor untuk terapi target spesifik
• Identifikasi organisme infeksi

Prinsip Dasar dan Metode

Prinsip dasar imunositokimia adalah menunjukkan antigen spesifik dalam sel dengan menerapkan antibodi yang sesuai untuk menciptakan reaksi antigen-antibodi. Antigen mengandung epitop atau situs penentu antigen yang memicu respons imun spesifik untuk membentuk antibodi. Situs ikatan antigen dan antibodi memiliki fitur geometris dan kimia yang komplementer, yang bertanggung jawab atas reaksi antigen-antibodi.

Konsep Dasar Imunologi, Antibodi (imunoglobulin) diproduksi oleh sel plasma sebagai respons terhadap stimulasi antigen dan memiliki afinitas spesifik terhadap epitop. Setiap imunoglobulin terdiri dari sepasang rantai ringan (κ dan λ) dan sepasang rantai berat (α, γ, δ, ε, dan μ), yang menentukan kelas imunoglobulin (IgA, IgG, IgD, IgE, dan IgM masing-masing). Antibodi memiliki struktur berbentuk Y dengan dua situs pengikatan antigen di ujung-ujung Y.

Jenis Antibodi, Antibodi Monoklonal: Dibuat melalui teknik hibridoma, di mana sel limfosit B yang memproduksi antibodi digabungkan dengan sel plasma ganas yang abadi. Sel hibrid yang dihasilkan memperoleh kemampuan proliferasi tak terbatas dan memproduksi antibodi spesifik untuk antigen tertentu. Setiap sel hibridoma hanya memproduksi satu antibodi spesifik untuk antigen tertentu.

Antibodi Poliklonal: Dihasilkan dari sel limfosit B yang berbeda sebagai respons terhadap epitop yang berbeda dari antigen tunggal. Karena berasal dari klon sel B yang berbeda, dapat terjadi variasi antar batch.

Sistem Deteksi

Tidak mungkin mendeteksi reaksi antigen-antibodi hanya dengan mikroskop cahaya. Oleh karena itu, sistem deteksi atau visualisasi yang berbeda diperlukan untuk menunjukkan reaksi tersebut:
Metode Langsung (direct): Antibodi primer langsung ditandai dengan enzim atau fluoresensi. Sederhana dan cepat tetapi memiliki sensitivitas yang lebih rendah.
Metode Tidak Langsung: Antibodi primer tidak ditandai, dan antibodi sekunder yang ditandai diarahkan terhadap antibodi primer. Lebih sensitif dan serbaguna.
Metode Peroxidase-Anti Peroxidase: Menggunakan zat imun kompleks yang terdiri dari antigen peroksidase lobak dan antibodi terhadap peroksidase lobak, dengan antibodi jembatan sekunder di antara antibodi primer dan kompleks PAP. 1000 kali lebih sensitif daripada metode tidak langsung.
Metode Avidin-Biotin: Memanfaatkan afinitas tinggi biotin terhadap avidin. Antibodi sekunder ditandai dengan biotin, dan avidin yang dikonjugasi dengan peroksidase digunakan. Sederhana tetapi dapat menimbulkan hasil positif palsu dari biotin endogen.
Prosedur Avidin-Biotin Konjugasi: Prosedur yang dimodifikasi menggunakan kompleks avidin-biotin dan peroksidase yang sudah terbentuk sebelumnya untuk visualisasi yang lebih baik.
Metode Biotin-Streptavidin: Mengganti avidin dengan streptavidin tetramerik yang langsung dikonjugasi dengan enzim, menawarkan amplifikasi dan deteksi yang lebih baik.
Metode Alkaline Phosphatase-Anti Alkaline Phosphatase: Menggunakan kompleks alkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase dengan antibodi penghubung sekunder. Berguna untuk jaringan dengan kadar peroksidase endogen tinggi.
Metode Penandaan Berbasis Polimer: Menggunakan tulang punggung polimer (dextran) dengan sejumlah besar molekul enzim dan antibodi sekunder yang dikonjugasi di dalamnya. Sederhana, sensitif, dan menghindari pewarnaan latar belakang.
Amplifikasi Sinyal yang Dikatalisis (Amplifikasi Sinyal Tyramine): Memanfaatkan sifat katalitik HRP dengan hidrogen peroksida untuk mengubah tyramine yang dibiotinilasi menjadi tyramide yang reaktif dan terikat pada tirosin jaringan.

Peralatan dan Reagen

Jenis Sampel
Histopatologi, Jaringan FFPE, irisan beku. Sitologi, Blok sel, sediaan sitologi berbasis cairan, sediaan sitologi langsung, persiapan cytospin

Reagen dan Bahan

• Antibodi (primer dan sekunder)
• Chromogens (DAB untuk HRP, Fast Red untuk AP)
• Buffer (TBS, buffer sitrat)
• Antigen retrieval solution
• Blocking solution (hidrogen peroksida, serum normal)
• Bahan pewarna kontras (hematoxylin)
• Media penutup
• Peralatan
• Mikrotom
• Bak air
• Microwave atau panci tekan (untuk Antigen retrieval)
• Kamar kelembaban
• Mikroskop
• Platform imunohistokimia otomatis (opsional)

Prosedur

Langkah-langkah dasar imunohistokimia meliputi:

1. Deparafinisasi dan Rehidrasi: Hapus parafin dan rehidrasi jaringan dengan alkohol bergradasi
2. Antigen retrieval: Jika diperlukan, gunakan panas (microwave, panci tekan, atau bak air)
3. Blocking Enzim Endogen: Oleskan 3% hidrogen peroksida dalam metanol selama 10 menit
4. Blocking Ikatan Non-spesifik: Oleskan 3% albumin serum sapi selama 30 menit
5. Aplikasi Antibodi Primer: Oleskan antibodi primer yang telah diencerkan dengan benar selama 30 menit
6. Pencucian: Bilas secara menyeluruh dengan TBS
7. Aplikasi Antibodi Sekunder: Oleskan antibodi sekunder yang telah diberi label selama 30 menit
8. Pencucian: Bilas secara menyeluruh dengan TBS
9. Aplikasi Chromogens: Oleskan Chromogens yang sesuai dan inkubasi selama 3-10 menit
10. Pewarnaan Kontras: Dengan hematoxylin selama 10 detik
11. Dehidrasi dan Pemasangan: Dehidrasi dengan alkohol, bersihkan dengan xylene, dan pasang dengan DPX

Metode Antigen retrieval
Fiksasi formalin sering menghasilkan hasil IHC yang tidak konsisten karena ikatan silang protein yang menghambat akses antibodi ke epitop. “Antigen retrieval” berarti memulihkan antigenisitas jaringan yang tertutup oleh fiksasi formalin. Beberapa metode meliputi:

• Pemulihan dengan Microwave: Metode paling efektif dan populer menggunakan buffer sitrat dan pemanasan terkontrol
• Pemanasan dengan Panci Tekanan: Memberikan pemanasan merata ke semua slide
• Pemanasan dengan Bak Air: Prosedur konvensional menggunakan bak air dengan suhu terkontrol

Interpretasi Hasil dan Kontrol Kualitas

Kontrol Kualitas

• Kontrol kualitas sangat penting dalam imunostaining dan meliputi:
  Fase Praanalitik: Fiksasi yang tepat dan persiapan slide
• Fase Analitik: Pemilihan dan validasi antibodi, Antigen retrieval
• Fase Pascaanalitik: Interpretasi hasil pewarnaan

Kontrol
Dalam pewarnaan IHC, kontrol yang tepat memvalidasi uji laboratorium: Kontrol Negatif, Antibodi primer dihilangkan; tidak boleh terjadi pewarnaan dan Kontrol Positif, Bagian jaringan yang diketahui mengandung antigen target

Masalah Umum dan Pemecahan Masalah

Tidak Ada Pewarnaan:

• Antibodi cacat
• Reagen hilang
• Antibodi terlalu encer
• Chromogens/substrat tidak sesuai
• Deparafinisasi tidak cukup
• Kerusakan antigen

Pewarnaan Latar Belakang:

• Antibodi sekunder yang bereaksi silang
• Seksi jaringan yang kering selama pewarnaan
• Chromogens yang tidak larut sepenuhnya
• Antibodi primer yang terlalu pekat
• Fiksasi berlebihan

Keuntungan dan Kerugian IHC

Keuntungan

• Esensial untuk diagnosis akurat berbagai kondisi
• Memungkinkan klasifikasi tumor dengan morfologi serupa
• Memberikan informasi prognosis melalui status reseptor
• Mengarahkan pemilihan terapi target
• Mengidentifikasi organisme infeksi
• Dapat dilakukan pada spesimen histologi dan sitologi

Kekurangan

• Membutuhkan peralatan khusus dan pelatihan
• Dapat memakan waktu
• Relatif mahal
• Potensi hasil positif/negatif palsu
• Variabilitas dalam interpretasi
• Membutuhkan kontrol dan validasi yang tepat
• Platform Imunostaining Otomatis

Laboratorium modern semakin menggunakan platform imunostaining otomatis (AIP) dengan keunggulan berikut:

• Mengurangi kebutuhan tenaga teknis
• Pengetahuan teknik minimal
• Mengurangi kesalahan manusia
• Hasil yang konsisten
• Tidak memerlukan pengawasan reagen
• Kapasitas throughput tinggi
• Namun, keterbatasan termasuk fleksibilitas terbatas, ketergantungan pada mesin, biaya, dan kebutuhan perawatan rutin.

Kesimpulan

Imunohistokimia telah merevolusi patologi diagnostik dengan memungkinkan visualisasi antigen spesifik dalam jaringan dan sel. Teknik ini terus berkembang dengan metode deteksi yang lebih baik dan otomatisasi. Memahami prinsip, aplikasi, dan potensi kendala IHC sangat penting untuk diagnosis akurat dan pengambilan keputusan terapeutik dalam patologi modern.

Referensi

1. Coons AH, Creech HJ, Jones RN. Sifat imunologis antibodi yang mengandung kelompok fluoresen. Exp Biol Med. 1941;47:200–2.
2. Nakane PK, Pierce GB. Antibodi yang dilabeli enzim untuk lokalisasi antigen jaringan dengan mikroskop cahaya dan elektron. J Cell Biol. 1967;33:307–18.
3. Taylor CR, Burns J. Demonstrasi sel plasma dan sel lain yang mengandung imunoglobulin pada jaringan yang difiksasi formalin dan diembedding parafin menggunakan antibodi yang dilabeli peroksidase. J Clin Pathol. 1974;27:14–20.
4. Dey P. Teknik Laboratorium Dasar dan Lanjutan dalam Histopatologi dan Sitologi. Springer Nature Singapore Pte Ltd. 2022.