Teknik ini dikembangkan untuk memenuhi kebutuhan mendasar dalam membedakan komponen nukleus dan sitoplasma pada irisan jaringan. Haematoxylin berfungsi sebagai pewarna nukleus yang sangat baik, menghasilkan pewarnaan biru kehitaman pada nukleus, sementara eosin bertindak sebagai pewarna kontras sitoplasma, memberikan pewarnaan merah muda hingga merah pada sitoplasma dan komponen matriks ekstraseluler.
Tujuan utama pewarnaan H&E adalah untuk memberikan visualisasi morfologis optimal dari arsitektur jaringan untuk diagnosis histopatologi yang akurat. Teknik ini bertujuan untuk menunjukkan morfologi nukleus secara jelas, termasuk pola kromatin dan nukleoli, sambil membedakan komponen sitoplasma dan kepadatan relatifnya. Metode pewarnaan ini mengungkapkan organisasi jaringan secara keseluruhan dan hubungan struktural, menetapkan dasar standar untuk penilaian morfologis. Selain itu, pewarnaan H&E berfungsi sebagai langkah pengendalian kualitas dasar di laboratorium histopatologi, memberikan hasil yang konsisten dan dapat diulang, yang memungkinkan patolog untuk mengidentifikasi kelainan seluler, pola jaringan, dan perubahan patologis yang esensial untuk diagnosis.
Prinsip
Mekanisme pewarnaan H&E beroperasi melalui interaksi kompleks antara reaksi kimia dan interaksi fisik. Haematoxylin mengalami oksidasi untuk membentuk haematin (hematein), yang memiliki kemampuan pewarnaan minimal. Oksidasi ini dapat terjadi secara alami melalui paparan udara selama beberapa bulan (pematangan) atau secara cepat melalui oksidasi kimia menggunakan agen seperti natrium iodat atau oksida merkuri. Langkah krusial melibatkan pembentukan kompleks pewarna-mordant, di mana haematin berikatan dengan garam logam (biasanya aluminium, besi, atau tungsten) untuk membentuk kompleks bermuatan positif. Kompleks kationik ini memiliki afinitas kuat terhadap asam nukleat bermuatan negatif di dalam inti sel, menghasilkan pewarnaan inti sel. Warna merah kecokelatan awal berubah menjadi biru khas melalui proses pembiruan, yang melibatkan peningkatan pH menjadi sekitar 8,5 menggunakan larutan alkali. Eosin, yang berfungsi sebagai pewarna asam (tetrabromofluorescein), mengikat protein sitoplasma bermuatan positif melalui interaksi ionik, memberikan kontras esensial terhadap pewarnaan nukleus dan menunjukkan variasi densitas sitoplasma dan komponen matriks ekstraseluler.
Jenis-jenis Haematoxylin
Hematoxylin dapat diklasifikasikan berdasarkan kombinasi dengan mordant yang berbeda, masing-masing menawarkan karakteristik pewarnaan dan aplikasi spesifik. Jenis utama meliputi hematoxylin besi, yang menggunakan garam besi sebagai mordant dan menghasilkan pewarnaan nukleus hitam intens; hematoxylin alum, jenis yang paling umum digunakan dengan garam aluminium untuk pewarnaan nukleus rutin; hematoxylin tungsten, menggunakan asam fosfotungstat untuk aplikasi khusus; haematoxylin timbal untuk komponen jaringan tertentu; haematoxylin molibdenum untuk pewarnaan selektif; dan haematoxylin tanpa mordant yang digunakan dalam teknik khusus. Pemilihan jenis haematoxylin tergantung pada persyaratan diagnostik spesifik, jenis jaringan, dan intensitas pewarnaan yang diinginkan.
Jenis Hematoxylin dan Sifatnya
Harris's Alum HematoxylinKomposisi:
Hematoxylin: 5 g Alkohol absolut: 50 ml Amonium alum: 100 g Air suling: 1000 ml Oksida merkuri: 2,5 g Asam asetat gliserin: 40 mlPersiapan:
- Larutkan haematoxylin dalam alkohol absolut
- Larutkan alum dalam air panas dan didihkan
- Campurkan kedua larutan
- Tambahkan oksida merkuri secara perlahan sambil dipanaskan
- Panaskan hingga warna berubah menjadi ungu gelap
- Dinginkan dengan cepat dalam air dingin
- Tambahkan asam asetat glacial ke larutan yang telah didinginkan
Komposisi:
Hematoxylin: 1 g Alum kalium atau amonium: 50 g Natrium iodat: 0,2 g Asam sitrat: 1 g Kloral hidrat: 50 g Air suling ganda: 1000 mlPersiapan:
- Larutkan haematoxylin, alum, dan natrium iodat dalam air
- Panaskan perlahan sambil diaduk
- Dinginkan hingga suhu ruangan
- Tambahkan kloral hidrat dan asam sitrat
- Rebus selama 4-5 menit
- Dinginkan dan saring
Komposisi:
Hematoxylin: 2 g Alkohol absolut: 100 ml Air suling: 100 ml Glycerol: 100 ml Asam asetat gliserin: 10 ml Aluminium kalium: 10-15 gPersiapan:
- Larutkan haematoxylin dalam alkohol absolut hingga larut sepenuhnya
- Tambahkan bahan-bahan lainnya
- Akhirnya, tambahkan Kalium alum (10-15 g) hingga terjadi saturasi penuh
- Simpan seluruh labu di bawah sinar matahari selama 2 bulan untuk pematangan
Komposisi:
Hematoxylin: 1,5 g Larutan kalium alum jenuh: 700 ml Iodium (1%) dalam etanol absolut (95%): 50 ml Air suling: 250 mlPersiapan:
- Tambahkan haematoxylin ke air suling
- Panaskan perlahan dan larutkan hingga benar-benar larut
- Campurkan larutan yodium dan alum
- Rebus
- Dinginkan dan saring larutan
Tabel Perbedaan antara Haematoxylin Mayer dan Harris
| Faktor | Hematoxylin Harris | Hematoxylin Mayer |
|---|---|---|
| Pelarut | Alkohol absolut | Air suling |
| Oksidator | Oksida merkuri | Natrium iodat |
| Bahan tambahan untuk mempertajam pewarnaan | Asam asetat gliserin | Hidrat kloral |
| Jenis noda | Noda progresif dan regresif | Noda progresif |
| Penggunaan utama | Sitologi eksfoliatif | Kontras noda nukleus dalam noda khusus |
| Waktu pewarnaan | 5-15 menit (regresif), 5-30 detik (progresif) | 5-10 menit (progresif), 10-20 menit (regresif) |
Tabel Jenis-Jenis Hematoxylin dan Sifat-Sifatnya
| Jenis Pewarnaan | Mordant yang Digunakan | Aplikasi | Waktu Pewarnaan | Keterangan |
|---|---|---|---|---|
| Hematoxylin Mayer | Aluminium potasium atau amonium | Pewarna nukleus yang populer | 5-10 menit (progresif), 10-20 menit (regresif) | Terbaik untuk pewarnaan otomatis |
| Hematoxylin Ehrlich | Aluminium kalium | Pewarna nukleus, juga mewarnai mukus, tulang, dan kartilago | 20-30 menit | Pematangan alami, pewarnaan lebih tahan lama |
| Hematoxylin Harris | Amonium atau Kalium alum | Pewarna nukleus yang baik dalam sitologi eksfoliatif | 5-15 menit (regresif), 5-30 detik (progresif) | Pematangan dengan oksida merkuri |
| Hematoxylin Gill | Sulfat aluminium | Pewarnaan nukleus yang baik | Pewarnaan regresif: 5-15 menit | Pewarnaan stabil selama 1 tahun |
| Hematoxylin Cole | Aluminium kalium | Pewarnaan nukleus yang baik | Pewarnaan regresif: 30 menit | Stabil selama 3 bulan |
Larutan Eosin
Larutan air: 1% eosin Y dalam air suling Larutan alkohol: 0,5% eosin Y dalam 95% etil alkoholReagen tambahan
- Xylene untuk deparafinisasi dan pembersihan
- Alkohol bergradasi (60%, 80%, 95%, 100%)
- Alkohol asam (1% HCl dalam 70% alkohol)
- Air keran Scott untuk pembiruan (2g natrium bikarbonat, 10g magnesium sulfat dalam 1L air)
- Media pemasangan DPX
Prosedur
- Deparafinisasi
- Xylene: 10 menit × 3 kali penggantian
- Rehidrasi
- Alkohol absolut: 1-2 menit
- Alkohol 95%: 1-2 menit
- Alkohol 80%: 1-2 menit
- Alkohol 60%: 1-2 menit
- Bilasan dengan air keran
- Pewarnaan nukleus
- Haematoxylin: 15 menit (Harris) atau 10-20 menit (Mayer)
- Pembedaan (untuk pewarnaan regresif)
- Alkohol asam: 1-2 kali celup cepat
- Periksa di bawah mikroskop untuk pewarnaan nukleus yang optimal
- Pewarnaan biru
- Air keran mengalir: 10-15 menit
- Alternatif: Air keran Scott selama 2-3 menit
- Pewarnaan kontras
- Eosin Y 1% dalam air: 2-3 menit
- Dehidrasi
- Alkohol 95%: 3 menit
- Alkohol absolut: 3 menit
- Alkohol absolut: 5 menit
- Pembersihan
- Xylene: 5 menit × 2 kali penggantian
- Pemasangan
- Pasang dalam DPX dengan penutup kaca
Hasil
| Komponen Jaringan | Warna | Deskripsi |
|---|---|---|
| Nukleus | Biru hingga hitam kebiruan | Kromatin dan nukleoli terlihat jelas |
| Sitoplasma | Pink hingga merah | Intensitas bervariasi tergantung kandungan protein |
| Serat kolagen | Pink | Komponen matriks ekstraseluler |
| Serat otot | Pink hingga merah | Penampilan bergaris pada otot rangka |
| Sel darah merah | Merah cerah | Pewarnaan eosinofilik yang intens |
| Mucin | Biru pucat hingga bening | Dapat tampak tidak terwarnai atau sedikit basofilik |
| Endapan kalsium | Biru gelap hingga ungu | Endapan mineral basofilik |
Ilustrasi
Catatan
Kontrol kualitas dalam pewarnaan H&E memerlukan perhatian teliti terhadap berbagai variabel yang dapat memengaruhi hasil pewarnaan. Pemantauan rutin intensitas pewarnaan menggunakan slide kontrol positif memastikan hasil yang konsisten antar batch. Usia dan pH reagen secara signifikan memengaruhi kualitas pewarnaan, dengan larutan haematoxylin menunjukkan penurunan efektivitas seiring waktu akibat oksidasi berlebihan, yang ditandai dengan pewarnaan nukleus yang pucat atau pembentukan endapan. Perubahan suhu selama pewarnaan dapat mengubah kinetika reaksi, sementara kualitas air memengaruhi proses pembiruan dan intensitas warna akhir. Kualitas fiksasi jaringan sangat memengaruhi karakteristik pewarnaan, dengan fiksasi yang terlalu lama mungkin memerlukan waktu pewarnaan yang lebih lama. Ketebalan irisan jaringan berkorelasi langsung dengan intensitas pewarnaan, dengan irisan yang lebih tebal memerlukan waktu pewarnaan yang lebih lama. Sistem pewarnaan otomatis memerlukan kalibrasi dan pemeliharaan rutin untuk memastikan reproduibilitas. Dokumentasi setiap penyimpangan dari protokol standar, termasuk nomor lot reagen dan tanggal persiapan, memudahkan pemecahan masalah saat terjadi anomali pewarnaan. Memahami variabel-variabel ini memungkinkan personel laboratorium untuk mempertahankan kualitas pewarnaan yang optimal dan dengan cepat mengidentifikasi sumber hasil yang kurang optimal.
Keuntungan dan Kerugian
Keuntungan- Aplikasi universal untuk diagnosis histopatologi rutin
- Kontras nukleus-sitoplasma yang excellent
- Efisien biaya dan reagen yang mudah diperoleh
- Protokol yang telah teruji dengan hasil yang konsisten
- Kompatibel dengan sistem pewarnaan otomatis
- Umur simpan yang panjang untuk irisan yang telah disiapkan
- Dasar yang ideal untuk perbandingan dengan pewarnaan khusus
- Spesifisitas terbatas untuk komponen seluler tertentu
- Tidak dapat membedakan protein atau enzim spesifik
- Potensi artefak akibat fiksasi atau pengolahan
- Membutuhkan pengalaman untuk interpretasi optimal
- Dapat menyembunyikan perubahan seluler yang halus
- Tidak cocok untuk semua persyaratan diagnostik (misalnya, patogen spesifik, penanda molekuler)
Referensi
- Chan JK. (2014). The wonderful colours of the hematoxylin-eosin stain in diagnostic surgical pathology. Int J Surg Pathol.22(1):12–32.
- King DF, King LA. (1986). A brief historical note on staining by hematoxylin and eosin. Am J Dermatopathol. 8:168.
- Brown PA. (1997). A review of technique used in the preparation, curation, and conservation of microscope slides at the natural history museum London. Biol Curator. 10:1–33.
- Dey P. (2023). Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. Singapore: Springer Nature Singapore Pte Ltd.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar