G-Banding dengan Pewarnaan Leishman's - G‐Banding with Leishman’s stain (GTL)

G-banding (Giemsa banding) merupakan metode pewarnaan pita kromosom yang paling umum digunakan di laboratorium sitogenetika, khususnya di Amerika Serikat. Teknik ini menghasilkan pola pita terang dan gelap yang khas di sepanjang kromosom, memungkinkan identifikasi positif setiap kromosom dan deteksi kelainan struktural. GTL (G-bands yang dihasilkan dengan trypsin dan pewarna Leishman's) merupakan varian spesifik dari G-banding yang menggunakan pewarna Leishman's sebagai pengganti pewarna Giemsa yang lebih umum. Metode ini sangat penting untuk diagnosis prenatal (khususnya amniosentesis untuk trisomi 21), investigasi keguguran berulang, dan diagnosis berbagai sindrom genetik serta kanker.

Tujuan

Tujuan utama G-banding dengan pewarna Leishman's adalah menyediakan metode analisis kromosom yang andal dan hemat biaya dalam sitogenetika klinis. Teknik ini bertujuan mencapai morfologi kromosom optimal dengan pola pita yang jelas dan berbeda, memungkinkan identifikasi akurat kelainan kromosom numerik dan struktural. Metode ini berupaya mempertahankan konsistensi di berbagai jenis sampel sambil memberikan resolusi yang memadai untuk diagnosis klinis.

Tujuan sekunder meliputi penetapan protokol standar yang dapat direproduksi di berbagai laboratorium, meminimalkan waktu penyelesaian untuk kasus mendesak, dan menyediakan rekaman permanen melalui pewarnaan non-fluoresens. Teknik ini juga berfungsi sebagai alat skrining untuk memandu pengujian molekuler lebih lanjut bila diperlukan, menjadikannya komponen penting dari strategi evaluasi sitogenetik yang komprehensif.

Prinsip

G-banding berfungsi untuk mengetahui struktur kromatin yang mendasari kromosom melalui pewarnaan diferensial. Teknik ini menghasilkan:

• Pita gelap (G-positive): Daerah ini kaya A-T, bereplikasi lambat, merupakan daerah heterokromatin yang mengandung relatif sedikit gen aktif
• Pita terang (G-negative): Daerah ini kaya G-C, bereplikasi awal, merupakan daerah eukromatin yang secara biologis lebih signifikan karena mengandung sebagian besar gen aktif

Pola pita dihasilkan dari ekstraksi protein diferensial selama perlakuan trypsin, menciptakan daerah hidrofobik dan kurang hidrofobik yang berinteraksi berbeda dengan pewarna. Pewarna Leishman's, seperti Giemsa, mengandung pewarna tiazin (khususnya azure B) dan pewarna eosin yang membentuk endapan secara preferensial di daerah hidrofobik.

Alat dan Bahan

Reagen (sesuai protokol dari The AGT Cytogenetics Laboratory Manual):

1. Larutan Kerja Buffer: Tablet buffer pH 7,0 dilarutkan dalam air deionisasi (stabil selama 3 minggu pada suhu ruang)
2. Hanks' Balanced Salt Solution (1×): Dengan Ca dan Mg, tanpa phenol red atau natrium bikarbonat
3. Larutan Natrium Fosfat Dibasik: 0,946 g Na₂HPO₄ dalam 100 mL air deionisasi (masa simpan: 1 tahun)
4. Stok Pewarna Leishman's: 0,8 g pewarna Leishman's dalam 500 mL metanol, dicampur dengan magnetic stirrer, diinkubasi pada 37°C selama 12-16 jam, disaring (gunakan dalam 1 bulan)
5. Larutan Kerja Leishman's: 10 mL stok pewarna + 30 mL larutan buffer pH 7,0 (siapkan segar setiap hari)
6. Larutan Kerja Trypsin-EDTA: 2 mL stok trypsin-EDTA (10×) + 2 mL larutan natrium fosfat + 36 mL larutan Hanks' (siapkan segar setiap hari)

Peralatan:

• Mikroskop phase contrast dengan objektif imersi minyak
• Oven 90°C untuk aging slide
• Coplin jars
• Kertas saring Whatman #1
• Magnetic stirrer

Prosedur

Persiapan Slide:

1. Kultur Sel: Kultur sel selama 4-7 hari tergantung jenis sel
2. Sinkronisasi: Tambahkan bahan kimia untuk menyinkronkan siklus sel agar mendapat hasil metafase maksimal
3. Pemanenan:
   • Tambahkan kolkisin atau kolsemid untuk menghentikan sel dalam metafase
   • Perlakukan dengan larutan hipotonik untuk mengembangkan sel dan menyebarkan kromosom
   • Fiksasi dengan metanol:asam asetat (3:1)
4. Pembuatan Slide: Teteskan suspensi sel pada slide bersih
5. Aging: Aging slide selama 30 menit dalam oven 90°C (penting untuk pita optimal)

Pewarnaan GTL:

1. Siapkan larutan kerja segar dalam Coplin jars
2. Perlakuan Trypsin: Celupkan slide dalam larutan trypsin (15 detik hingga 2+ menit tergantung jenis jaringan, suhu, dan kelembaban - mulai dengan 30 detik)
3. Blot: Buang kelebihan trypsin dengan menempelkan tepi slide pada tisu
4. Pewarnaan: Letakkan dalam larutan kerja Leishman's selama 2 menit
5. Bilas: Bilas dengan air deionisasi
6. Keringkan: Keringkan dengan udara atau gunakan air jet
7. Analisis: Aplikasikan minyak langsung pada slide tanpa coverslip

Interpretasi Hasil

Tabel Resolusi Pita

Tingkat Resolusi	Jumlah Pita (per set haploid)	Tahap Sel	Aplikasi Klinis
Standar Minimum	~300 pita	Metafase	Skrining rutin
Kualitas Sedang	400-450 pita	Metafase tengah	Diagnosis standar
Kualitas Tinggi	500-550 pita	Metafase awal	Analisis terperinci
Prometafase	850+ pita	Prometafase	Kelainan halus

Identifikasi Kromosom:

Setiap kromosom menampilkan pola pita unik mengikuti standar ISCN (International System for Human Cytogenetics Nomenclature):

• Lengan pendek disebut sebagai "p"
• Lengan panjang disebut sebagai "q"
• Pita diberi nomor dari sentromer ke arah luar

Kelainan Umum yang Terdeteksi:

• Aberasi numerik (trisomi, monosomi)
• Penataan ulang struktural (delesi, duplikasi, translokasi, inversi)
• Kelainan halus menjadi lebih terlihat dengan resolusi pita yang lebih tinggi

Quality Control

Mempertahankan kualitas konsisten dalam G-banding memerlukan perhatian cermat terhadap berbagai variabel sepanjang proses. Usia slide secara signifikan mempengaruhi kualitas pita, dengan slide yang di-aging dengan benar (30 menit pada 90°C) menunjukkan definisi pita optimal. Slide segar sering menghasilkan pita yang buruk, sementara slide yang terlalu lama di-aging dapat menunjukkan penyebaran kromosom berlebihan dan hilangnya morfologi.

Kontrol suhu dan kelembaban selama proses pewarnaan sangat penting. Kelembaban tinggi dapat memperpanjang waktu pencernaan trypsin, sementara kelembaban rendah mungkin memerlukan perlakuan yang lebih singkat. Suhu laboratorium harus dipertahankan antara 20-25°C untuk hasil yang konsisten. pH semua larutan harus dipantau dengan cermat, karena variasi dapat secara dramatis mempengaruhi kualitas pewarnaan.

Skenario troubleshooting umum meliputi overtrypsinization, di mana kromosom tampak membengkak dengan penyerapan pewarna yang buruk, memerlukan pengurangan waktu paparan trypsin. Undertrypsinization menghasilkan definisi pita yang buruk dan memerlukan perlakuan yang diperpanjang. Pita tidak merata di seluruh slide sering menunjukkan aging slide yang tidak tepat atau aplikasi trypsin yang tidak merata, memerlukan perbaikan teknik dan persiapan larutan segar.

Quality Assurance

Program jaminan kualitas yang komprehensif memastikan hasil yang andal dan dapat direproduksi dalam sitogenetika klinis. Setiap batch reagen harus diuji dengan slide kontrol sebelum digunakan pada sampel pasien. Kontrol kualitas harian meliputi menjalankan slide uji untuk setiap pasien untuk mengoptimalkan waktu trypsin dan pewarnaan berdasarkan kondisi laboratorium saat ini. Dokumentasi semua variabel termasuk suhu, kelembaban, nomor lot reagen, dan waktu pemrosesan memungkinkan troubleshooting dan mempertahankan konsistensi.

Uji kemampuan rutin melalui program penilaian kualitas eksternal memvalidasi kinerja laboratorium. Audit internal harus meninjau persentase kasus untuk akurasi analisis dan pelaporan. Jadwal pemeliharaan peralatan, khususnya untuk mikroskop dan oven, harus diikuti dengan ketat. Penilaian kompetensi staf memastikan semua teknolog mempertahankan standar tinggi dalam persiapan dan analisis slide. Sistem pencitraan digital memerlukan kalibrasi rutin untuk memastikan pengukuran kromosom yang akurat dan dokumentasi pola pita.

Aplikasi Klinis

Penggunaan Utama:

1. Diagnosis Prenatal: Deteksi kelainan kromosom pada cairan amnion atau sampel CVS
2. Sitogenetika Kanker: Subtyping leukemia, limfoma, dan tumor padat untuk diagnosis dan prognosis
3. Kelainan Konstitusional: Investigasi fitur dismorfik, retardasi mental, kesulitan belajar
4. Masalah Reproduksi: Analisis kasus keguguran berulang

Keuntungan:

• Teknik non-fluoresens dengan hasil permanen
• Stabilitas lebih baik dibandingkan metode fluoresens
• Kemampuan resolusi tinggi
• Hemat biaya untuk analisis rutin

Keterbatasan

Meskipun digunakan secara luas, G-banding dengan pewarna Leishman's memiliki keterbatasan inheren yang harus dikenali. Teknik ini tidak dapat mendeteksi kelainan kromosom yang lebih kecil dari 2-3 megabase secara andal, membuatnya tidak cocok untuk mengidentifikasi mikrodelesi atau duplikasi. Kelainan dalam pita G-negative (terang) sangat sulit untuk divisualisasikan karena sifat pewarnaan inheren dari daerah eukromatin ini. Kualitas hasil sangat bergantung pada pengalaman dan keterampilan ahli sitogenetika, memperkenalkan potensi subjektivitas dalam interpretasi.

Resolusi bervariasi secara signifikan berdasarkan jenis sel, dengan limfosit darah umumnya memberikan resolusi lebih baik daripada sel cairan amnion, yang pada gilirannya melebihi kualitas yang dapat diperoleh dari sebagian besar sel tumor. Teknik ini memerlukan sel yang membelah, membatasi aplikasinya pada sampel dengan aktivitas mitosis rendah. Di era molekuler modern, G-banding berfungsi terutama sebagai alat skrining, dengan temuan abnormal sering memerlukan konfirmasi atau karakterisasi lebih lanjut dengan metode molekuler. Namun, ini tetap menjadi satu-satunya metode praktis untuk mendeteksi penataan ulang seimbang dan memberikan gambaran struktural genom secara menyeluruh dengan biaya yang wajar.

Catatan

Keselamatan laboratorium sangat penting saat melakukan prosedur G-banding. Semua bahan kimia harus ditangani sesuai dengan Lembar Data Keselamatan (Safety Data Sheets/SDS), dengan perhatian khusus pada pewarna berbasis metanol yang memerlukan pekerjaan di area berventilasi baik atau lemari asam. Alat pelindung diri termasuk sarung tangan, jas laboratorium, dan kacamata keselamatan harus dipakai setiap saat. Trypsin, sebagai enzim proteolitik, dapat menyebabkan sensitisasi dan reaksi alergi dengan paparan berulang, memerlukan penanganan hati-hati untuk menghindari inhalasi atau kontak kulit.

Pembuangan limbah harus mengikuti protokol institusional dan peraturan, dengan wadah terpisah untuk limbah yang mengandung metanol, larutan trypsin, dan bahan yang terkontaminasi. Prosedur darurat termasuk stasiun pencuci mata dan pancuran keselamatan harus mudah diakses. Staf harus menerima pembaruan pelatihan keselamatan rutin dan akrab dengan prosedur pembersihan tumpahan. Pekerja hamil harus berkonsultasi dengan kesehatan kerja mengenai risiko potensial dari paparan bahan kimia, khususnya uap metanol.

Kesimpulan

G-banding dengan pewarna Leishman's tetap menjadi teknik fundamental dalam sitogenetika klinis meskipun ada kemajuan metode molekuler. Kemampuannya untuk memberikan pandangan menyeluruh struktur kromosom dengan biaya relatif rendah membuatnya sangat berharga untuk skrining awal. Keberhasilan teknik ini sangat bergantung pada pelaksanaan protokol yang tepat dan interpretasi yang berpengalaman. Meskipun teknik molekuler menawarkan resolusi lebih tinggi, GTL banding terus memainkan peran penting dalam mendeteksi penataan ulang seimbang dan memberikan gambaran kromosom komprehensif yang memandu pengujian lebih lanjut.

Referensi

1. Arsham MS, Barch MJ, Lawce HJ. (2017). The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. 4th ed. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell.
2. Chauhan A. (2023). Principle and Techniques of Chromosome Banding: A Primitive Method for Chromosome Analysis. In: Essentials of Basic and Applied Sciences. 19-22. DOI: 10.13140/RG.2.2.34158.63042
3. Gersen SL, Keagle MB, eds. (2013). The Principles of Clinical Cytogenetics. 3rd ed. New York: Springer-Verlag.
4. International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN). (2020). Basel: S. Karger.