Pengukuran hemoglobin (Hb) merupakan salah satu pemeriksaan laboratorium yang penting dan sering dilakukan dalam hematologi klinis. Penentuan konsentrasi hemoglobin yang akurat sangat penting untuk diagnosis dan pemantauan berbagai gangguan hematologi, terutama anemia dan eritrositosis. Hemoglobin adalah kromoprotein yang terdiri dari dua rantai α dan dua rantai β dengan empat gugus heme, memiliki berat molekul terhitung 64.458 (anhidrat) dengan konsentrasi besi 0,347% (b/b).
Metode sianhemoglobin, yang juga dikenal sebagai metode hemoglobinsianida, telah diadopsi secara universal sebagai standar rujukan untuk penentuan hemoglobin. Metode ini secara resmi direkomendasikan oleh International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) pada tahun 1967 dan tetap menjadi standar emas untuk prosedur manual maupun otomatis. Penerimaan luas metode ini berasal dari akurasi, reprodusibilitas, dan kemampuannya mengukur semua bentuk hemoglobin kecuali sulfhemoglobin.
Konsentrasi hemoglobin darah sangat penting untuk transport oksigen dan karbon dioksida yang memadai antara paru-paru dan jaringan lain. Penurunan konsentrasi hemoglobin dapat terjadi akibat perdarahan, hemolisis, atau gangguan pembentukan darah di sumsum tulang. Sebaliknya, peningkatan konsentrasi hemoglobin dapat terjadi ketika pertukaran gas melalui paru-paru terganggu atau pada berbagai gangguan lain. Oleh karena itu, pengukuran hemoglobin berfungsi sebagai alat skrining awal untuk mendeteksi anemia (penurunan hemoglobin) atau eritrositosis (peningkatan jumlah sel darah merah dan konsentrasi hemoglobin).
Tujuan
Tujuan utama penentuan hemoglobin menggunakan metode sianhemoglobin meliputi penilaian kuantitatif untuk menentukan secara akurat konsentrasi hemoglobin total dalam sampel darah lengkap, skrining penyakit untuk mendeteksi anemia, polisitemia, dan gangguan hematologi lainnya, pemantauan pengobatan untuk memantau efek terapi obat, terapi radiasi, dan perkembangan penyakit, standardisasi untuk menyediakan metode yang terstandar dan dapat direproduksi yang dapat digunakan di berbagai laboratorium di seluruh dunia, serta kontrol kualitas untuk menetapkan metode rujukan yang handal untuk kalibrasi teknik pengukuran hemoglobin lainnya.
Prinsip
Metode sianhemoglobin melalui proses konversi kimia dua tahap. Pada tahap pertama, terjadi oksidasi di mana besi ferro (Fe²⁺) dalam hemoglobin dioksidasi menjadi keadaan ferri (Fe³⁺) oleh kalium ferisianida [K₃Fe(CN)₆], membentuk methemoglobin:
\[\text{HbFe}^{2+} + \text{Fe}^{3+}(\text{CN})_6^{3-} \rightarrow \text{HbFe}^{3+} + \text{Fe}^{2+}(\text{CN})_6^{4-}\]
Pada tahap kedua, terjadi pengikatan sianida di mana methemoglobin kemudian bergabung dengan kalium sianida (KCN) untuk membentuk pigmen sianhemoglobin (hemoglobinsianida) yang stabil:
\[\text{HbFe}^{3+} + \text{CN}^- \rightarrow \text{HbFe}^{3+}\text{CN}^-\]
Sianhemoglobin yang dihasilkan menunjukkan spektrum absorpsi karakteristik dengan absorbansi maksimum pada 540 nm. Densitas optik larutan berbanding lurus dengan konsentrasi hemoglobin, memungkinkan kuantifikasi akurat melalui pengukuran spektrofotometri. Detergen nonionik yang ada dalam reagen memiliki dua fungsi penting yaitu meningkatkan lisis sel darah merah dan mengurangi kekeruhan yang diakibatkan oleh protein abnormal seperti lipoprotein. Metode ini berhasil mengubah semua bentuk hemoglobin (oksihemoglobin, karboksihemoglobin, methemoglobin) kecuali sulfhemoglobin menjadi kompleks sianhemoglobin yang stabil.
Peralatan dan Bahan
PeralatanSpektrofotometer yang mampu mengukur pada 540 nm (atau 546 nm dengan lampu merkuri), tabung reaksi (13 × 100 mm), mikropipet (kapasitas 0,02 mL dengan presisi tinggi), kuvet (plan-paralel, panjang lintasan 1 cm), sentrifuge (untuk sampel keruh), timer untuk waktu reaksi, dan pH meter (untuk verifikasi pembuatan reagen).
Bahan dan ReagenKomponen reagen primer meliputi kalium ferisianida [K₃Fe(CN)₆] 200 mg/L (0,6 mmol/L), kalium sianida (KCN) 50 mg/L (0,75 mmol/L), dihidrogen kalium fosfat (KH₂PO₄) 140 mg/L, detergen nonionik 1 mL/L (0,1 g/L), air suling untuk membuat 1 liter, dan buffer fosfat 1 mmol/L. Bahan kontrol kualitas meliputi kontrol hemoglobin normal, kontrol hemoglobin abnormal, dan kalibrator sianhemoglobin (standar rujukan bersertifikat).
Pembuatan ReagenUntuk reagen kerja (Reagen HiCN/Hemoglobinsianida), larutan Drabkin tradisional terdiri dari kalium ferisianida [K₃Fe(CN)₆] 200 mg, kalium sianida (KCN) 50 mg, natrium bikarbonat (NaHCO₃) 1000 mg, dan air suling hingga 1000 mL. Namun, reagen Van Kampen-Zijlstra yang dimodifikasi (direkomendasikan) dibuat dengan melarutkan 200 mg kalium ferisianida dalam sekitar 800 mL air suling, menambahkan 50 mg kalium sianida dan melarutkan sempurna, menambahkan 140 mg dihidrogen kalium fosfat (KH₂PO₄), menambahkan 1 mL detergen nonionik yang sesuai, menyesuaikan volume hingga 1000 mL dengan air suling, dan memverifikasi pH 7,0-7,4 menggunakan pH meter.
Spesifikasi kontrol kualitas meliputi warna kuning pucat, densitas optik 0,0 pada 540 nm terhadap blanko air, pH 7,0-7,4, kejernihan kristal jernih tanpa kekeruhan, penyimpanan dalam botol coklat pada suhu ruang, stabilitas beberapa bulan bila disimpan dengan baik, dan kriteria pembuangan jika reagen menjadi keruh atau pembacaan blanko >0,010.
Prosedur
Pengumpulan dan Penanganan SampelJenis spesimen yang digunakan adalah darah lengkap dengan antikoagulan EDTA atau dapat juga menggunakan darah kapiler. Stabilitas sampel adalah 48 jam pada suhu 2-8°C atau 24 jam pada suhu ruang (<25°C). Persiapan sampel dilakukan dengan menghomogenkan spesimen secara menyeluruh sebelum pengujian.
Prosedur ManualProtokol langkah demi langkah dimulai dengan menyiapkan tabung reaksi diberi label untuk blanko, kalibrator, kontrol, dan sampel pasien. Selanjutnya dilakukan dispensing reagen dengan menambahkan tepat 5,0 mL reagen HiCN ke setiap tabung. Penambahan sampel dilakukan dengan menambahkan 0,02 mL darah lengkap yang telah dicampur baik ke tabung yang sesuai. Pencampuran dilakukan dengan membilas pipet 3-5 kali dengan reagen HiCN untuk memastikan transfer sampel yang lengkap. Inkubasi dilakukan dengan membiarkan pada suhu ruang selama minimal 3 menit (hingga 15 menit untuk konversi lengkap). Pembacaan dilakukan dengan memindahkan ke kuvet dan membaca pada 540 nm menggunakan blanko reagen sebagai referensi.
Perhitungan
Metode Perhitungan PrimerMenggunakan kalibrator sianhemoglobin bersertifikat:
\[\text{Hemoglobin (g/dL)} = \frac{A_{\text{sampel}}}{A_{\text{kalibrator}}} \times C_{\text{kalibrator}}\]
Di mana:
- \(A_{\text{sampel}}\) = Absorbansi sampel pasien
- \(A_{\text{kalibrator}}\) = Absorbansi kalibrator
- \(C_{\text{kalibrator}}\) = Konsentrasi kalibrator (mg/dL)
Tabel Parameter Pengukuran
| Parameter | Spesifikasi |
|---|---|
| Panjang gelombang | 540 nm (primer), 546 nm (lampu Hg), 520-560 nm (rentang yang dapat diterima) |
| Panjang lintasan | 1,000 cm (±0,5%) |
| Suhu | 20-25°C |
| Waktu reaksi | Minimal 3 menit |
| Pengenceran sampel | 1:251 (0,02 mL dalam 5,0 mL) |
| Stabilitas | 1 jam jauh dari cahaya |
Tabel Spesifikasi Panjang Gelombang
| Panjang Gelombang (nm) | Aplikasi | Faktor Konversi (g/dL) | Faktor Konversi (g/L) | Faktor mmol/L |
|---|---|---|---|---|
| 530 | Alternatif | Abs × 38,61 | Abs × 386,1 | Abs × 23,96 |
| 540 | Standar Primer | Dihitung dari kalibrator | Dihitung dari kalibrator | Dihitung |
| 546 | Lampu merkuri | Abs × 36,77 | Abs × 367,7 | Abs × 22,82 |
| 550 | Alternatif | Abs × 37,62 | Abs × 376,2 | Abs × 23,34 |
Pembuatan Kurva Standar
Menggunakan kalibrator HiCN bersertifikat, dilakukan pengenceran sebagai berikut:
| Tabung | Reagen HiCN (mL) | Standar (mL) | Konsentrasi Hemoglobin |
|---|---|---|---|
| 1 | 0,0 | 5,0 | 100% dari nilai standar |
| 2 | 1,0 | 4,0 | 80% dari nilai standar |
| 3 | 2,0 | 3,0 | 60% dari nilai standar |
| 4 | 3,0 | 2,0 | 40% dari nilai standar |
Plot densitas optik (sumbu y) versus konsentrasi hemoglobin (sumbu x) untuk memperoleh hubungan garis lurus.
Interpretasi Hasil
Nilai Pediatrik| Usia | Pria (g/dL) | Pria (g/L) | Wanita (g/dL) | Wanita (g/L) |
|---|---|---|---|---|
| Lahir | 15,0-20,0 | 150-200 | 15,0-20,0 | 150-200 |
| 2 bulan | 9,0-14,0 | 90-140 | 9,0-14,0 | 90-140 |
| 6 bulan | 11,1-14,1 | 111-141 | 11,1-14,1 | 111-141 |
| 1 tahun | 11,3-14,1 | 113-141 | 11,3-14,1 | 113-141 |
| 2-5 tahun | 11,0-14,0 | 110-140 | 11,0-14,0 | 110-140 |
| 10 tahun | 12,0-15,0 | 120-150 | 12,0-15,0 | 120-150 |
Nilai Dewasa
| Kelompok Usia | Pria (g/dL) | Pria (g/L) | Wanita (g/dL) | Wanita (g/L) |
|---|---|---|---|---|
| 12-14 tahun | 12,0-16,0 | 120-160 | 11,5-15,0 | 115-150 |
| 15-17 tahun | 11,7-16,6 | 117-166 | 11,7-15,3 | 117-153 |
| 18-44 tahun | 13,2-17,3 | 132-173 | 11,7-15,5 | 117-155 |
| 45-64 tahun | 13,1-17,2 | 131-172 | 11,7-16,0 | 117-160 |
| 65-74 tahun | 12,6-17,4 | 126-174 | 11,7-16,1 | 117-161 |
- Anemia: Hemoglobin di bawah rentang rujukan untuk usia dan jenis kelamin
- Polisitemia: Hemoglobin di atas rentang rujukan
- Anemia ringan: 1-2 g/dL di bawah normal
- Anemia sedang: 2-4 g/dL di bawah normal
- Anemia berat: >4 g/dL di bawah normal
Catatan
Pertimbangan Prosedural KritisWaktu reaksi merupakan faktor penting di mana reagen Van Kampen-Zijlstra yang dimodifikasi memungkinkan pembacaan setelah 3 menit dibandingkan 15 menit yang diperlukan untuk reagen Drabkin asli karena substitusi KH₂PO₄ untuk NaHCO₃. Manajemen kekeruhan juga perlu diperhatikan, jika sampel tampak keruh, lakukan sentrifugasi dan gunakan supernatan. Untuk jumlah WBC yang sangat tinggi (>25 × 10⁹/L), sentrifugasi wajib dilakukan. Sampel lipemik memerlukan persiapan blanko plasma.
Varian hemoglobin seperti HbS dan HbC dapat menyebabkan kekeruhan, sehingga perlu dilakukan pengenceran 1:1 dengan air suling dan hasil dikalikan 2. Overestimasi dapat terjadi dengan HbC, HbS, gangguan hati, atau presipitasi globulin. Kondisi penyimpanan juga penting, simpan reagen dalam botol coklat jauh dari cahaya, jangan biarkan membeku, dan periksa pembacaan blanko secara teratur (harus <0,010). Tindakan pencegahan keselamatan meliputi penanganan KCN dengan sangat hati-hati selama persiapan, memastikan ventilasi yang memadai, dan membuang larutan yang mengandung sianida dengan pembilasan air yang banyak.
Karakteristik Kinerja
Kinerja Analitik- Batas deteksi: 0,3 g/dL
- Rentang pengukuran: 4,5-36 g/dL
- Linearitas: Linear sepanjang rentang pengukuran
- Sensitivitas: ~0,272 unit absorbansi per 10 g/dL pada 546 nm
| Parameter | Dalam-run (n=20) | Antar-run (n=20) |
|---|---|---|
| Rerata level rendah | 6,7 g/dL | 6,3 g/dL |
| Standar deviasi | 0,05 g/dL | 0,29 g/dL |
| Koefisien variasi | 0,7% | 4,6% |
| Rerata level tinggi | 18,9 g/dL | 17,1 g/dL |
| Standar deviasi | 0,1 g/dL | 0,42 g/dL |
| Koefisien variasi | 0,6% | 2,5% |
Studi Interferensi
- Asam askorbat: Tidak ada interferensi hingga 25 mg/dL
- Bilirubin: Tidak ada interferensi hingga 330 μmol/L
- Glukosa: Tidak ada interferensi hingga 1000 mg/dL
- Kekeruhan: Interferensi positif dari 0,275 unit absorbansi
- Lipemia: Menyebabkan interferensi positif
Keunggulan dan Keterbatasan
KeunggulanMetode sianhemoglobin memiliki berbagai keunggulan yang menjadikannya standar emas dalam pengukuran hemoglobin. Standardisasi internasional sebagai metode rujukan yang diakui oleh ICSH memastikan konsistensi hasil global. Akurasi tinggi dengan korelasi sangat baik dengan metode lain (r = 0,9962) dan presisi yang ditunjukkan oleh koefisien variasi rendah dalam studi dalam-run dan antar-run menjadikannya sangat handal. Stabilitas produk reaksi memungkinkan pembacaan yang tertunda, sementara keserbagunaan membuatnya cocok untuk sistem manual dan otomatis. Metode ini komprehensif karena mengukur semua bentuk hemoglobin kecuali sulfhemoglobin. Reprodusibilitas dijamin melalui metodologi terstandar yang memastikan hasil konsisten di berbagai laboratorium. Dari segi ekonomi, metode ini hemat biaya dengan reagen dan peralatan yang relatif murah. Rentang pengukuran yang luas membuatnya cocok untuk sampel anemik maupun polisitemik, dan tersedianya standar rujukan yang mapan memudahkan kontrol kualitas.
KeterbatasanMeskipun memiliki banyak keunggulan, metode ini juga memiliki beberapa keterbatasan yang perlu dipertimbangkan. Bahaya keselamatan merupakan perhatian utama karena mengandung senyawa sianida toksik yang memerlukan penanganan hati-hati. Masalah lingkungan timbul karena pembuangan limbah sianida memerlukan prosedur khusus. Waktu reaksi yang memerlukan periode inkubasi minimal 3 menit dapat menjadi kendala dalam situasi darurat. Kerentanan terhadap interferensi dari jumlah WBC tinggi, lipemia, dan varian hemoglobin tertentu dapat mempengaruhi akurasi hasil. Ketergantungan pada peralatan spektrofotometer untuk pengukuran akurat membatasi penggunaannya di tempat dengan sumber daya terbatas. Ketidakstabilan reagen yang dapat menjadi keruh dan harus dibuang, serta masa simpan terbatas terutama setelah dibuka, menambah kompleksitas pengelolaan. Sensitivitas terhadap suhu yang memerlukan kondisi suhu terkontrol dan kebutuhan volume sampel yang memadai untuk pipetting akurat juga menjadi pertimbangan. Kebutuhan akan keahlian teknis untuk hasil yang akurat menekankan pentingnya pelatihan personel yang memadai.
Kesimpulan
Metode sianhemoglobin tetap menjadi standar emas untuk penentuan hemoglobin di laboratorium klinis di seluruh dunia. Adopsinya oleh International Committee for Standardization in Haematology telah memastikan standardisasi global dan komparabilitas hasil. Akurasi, presisi, dan reprodusibilitas metode ini menjadikannya sangat diperlukan untuk diagnosis dan pemantauan gangguan hematologi.
Meskipun terdapat kekhawatiran keselamatan terkait penanganan sianida dan keterbatasan analitik tertentu, keunggulan metode ini secara signifikan melebihi kekurangannya. Ketersediaan standar rujukan bersertifikat, prosedur kontrol kualitas yang mapan, dan data validasi yang ekstensif mendukung penggunaan berkelanjutan sebagai metode rujukan primer.
Analisis hematologi otomatis modern telah berhasil mengadaptasi prinsip ini, menggabungkan langkah-langkah keselamatan dan presisi yang ditingkatkan sambil mempertahankan kimia fundamental. Kemampuan metode ini untuk mengukur semua bentuk hemoglobin yang signifikan secara klinis, dikombinasikan dengan kinerja analitik yang sangat baik, memastikan relevansinya yang berkelanjutan dalam kedokteran laboratorium kontemporer.
Pengembangan masa depan mungkin berfokus pada metode alternatif yang menghilangkan penggunaan sianida sambil mempertahankan akurasi dan presisi yang sebanding. Namun, metodologi baru apa pun harus menunjukkan kesetaraan dengan metode sianhemoglobin untuk memastikan kontinuitas interpretasi klinis dan perawatan pasien.
Metode sianhemoglobin mencontohkan pentingnya prosedur analitik terstandar dalam kedokteran laboratorium klinis, menyediakan fondasi untuk diagnosis akurat, pemantauan pengobatan, dan manajemen pasien dalam gangguan hematologi.
Referensi
- International Committee for Standardization in Haematology. (1967). Recommendations for haemoglobinometry in human blood. British Journal of Haematology, 13(Suppl.), 71-75.
- Drabkin, D.L., & Austin, J.H. (1935). Spectrophotometric studies on the preparation and properties of the crystalline hemoglobin of man. Journal of Biological Chemistry, 112, 51-65.
- Van Kampen, E.J., & Zijlstra, W.G. (1961). Standardization of hemoglobinometry: The hemiglobincyanide method. Clinica Chimica Acta, 6, 538-544.
- Van Kampen, E.J., & Zijlstra, W.G. (1965). Determination of hemoglobin and its derivatives. Advances in Clinical Chemistry, 8, 141-187.
- Burtis, C.A., & Ashwood, E.R. (Eds.). (1999). Tietz Textbook of Clinical Chemistry (3rd ed., pp. 1673-1674). W.B. Saunders Company.
- Brown, B.A. (1993). Hematology: Principles and Procedures (6th ed., pp. 83-85). Lea & Febiger.
- BIOLABO. (2022). Haemoglobin colorimetric method (Cyanmethemoglobin) - Instructions for use. REF 3502200, Version 02.
- Holtz, A.H. (1965). Standardization, documentation and normal values in haematology. Bibliotheca Haematologica, 21, 75.
- Eilers, R.J. (1967). Notification of adoption of an international method and standard solution for hemoglobinometry. American Journal of Clinical Pathology, 47, 212-214.
- Zijlstra, W.G., & van Kampen, E.J. (1960). Hemoglobin measurement and its standardization. Clinica Chimica Acta, 5, 719-726.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar